基于靶向多肽的循环肿瘤细胞捕获方法及微流芯片与流程

本发明涉及一种肿瘤细胞捕捉方法及设备，特别是一种利用多肽在微流控芯片中捕获循环肿瘤细胞的方法及相应系统，属于生物、医药技术领域。

背景技术：

现在，癌症仍然是全球致死率最高的疾病之一，癌症的转移更是导致其治疗困难的一大主因。从原发灶脱落的癌细胞随血液或淋巴流布全身，一旦条件成熟，这些癌细胞会像种子一样在身体的任何组织器官生长起来，破坏脏器功能，最终导致病人死亡。90％的癌症病人都是死于肿瘤转移，因此，对恶性肿瘤侵袭转移的研究是攻克肿瘤疾病的关键所在。传统的肿瘤转移检测方法只有在转移病灶引起异常症状或影像学检查发现转移灶时才确诊转移发生，而此时往往已经失去有效治疗的时机。开发新的创伤小灵敏度高特异性好的肿瘤转移检测方法是目前肿瘤研究中的热点，这其中通过外周血肿瘤细胞水平来判断肿瘤转移风险是众多研究者努力的方向。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。CTCs在血液中极少，在癌症已经发生转移的病人体内，大约每10⁹个血细胞中存在一个CTC，因此CTCs的分离与检测在技术上极具挑战性。理想的检测CTCs的方法应该具有较高的灵敏度和可重复性，而且应该容易应用到临床。由于到现在为止还没有一个特异的指标可以将CTCs和正常的血液细胞区分开，所以导致CTCs的检测变得复杂。微流控芯片用于分离和检测CTCs有着很大的优势，它可以顺利地从全血中捕获较多数量的CTCs。

目前利用生物学方法捕获循环肿瘤细胞主要是通过针对循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体或核酸适配体实现循环肿瘤细胞的捕获并与血液中其他细胞分离。但是抗体的生产价格昂贵，用于大量生产时会很大地增加成本，而且抗体的分子量大，在用于捕获细胞时会由于空间位阻而导致抗体与细胞上特异的靶分子接触受阻；而核酸适配体的稳定性不足，易被核酸酶降解。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种基于靶向多肽的循环肿瘤细胞捕获方法及微流芯片，其可实现对于不同类型循环肿瘤细胞的特异性捕捉，从而克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种基于靶向多肽的循环肿瘤细胞捕获微流芯片，其包括：

用以使可能含目标循环肿瘤细胞的液体样品流经的流道，

以及，固定连接于所述流道内的循环肿瘤细胞特异性结合多肽，用以从所述液体样品中捕捉所述目标循环肿瘤细胞。

进一步的，所述循环肿瘤细胞特异性结合多肽经化学键合方式固定连接在所述流道的内壁上。

进一步的，所述系统还包括红细胞裂解试剂，用以去除血液样品中的红细胞。

其中，所述微流控芯片可以采用业界所知的任何合适形式或结构的。

在一较佳实施方案之中，所述微流芯片内分布有一条以上流道，其中至少一流道具有由两个以上曲线形结构单元组成的波浪形曲线结构。

尤为优选的，所述曲线形结构单元的曲率为0.3-0.4mm，宽度为80-120μm，高度为30-40μm。

在一具体实施方案之中，所述微流芯片包括通过不可逆键合而固定连接的盖片和载板，盖片和载板之间分布有复数条流道。

其中，所述多肽可以是能与相应循环肿瘤细胞特异性结合的任意靶向性多肽，例如A549细胞靶向多肽A-1(参阅专利ZL201110340669.1)。

一种基于靶向多肽的循环肿瘤细胞捕获方法，其包括：

提供微流芯片，并在所述芯片的流道内固定连接循环肿瘤细胞特异性结合多肽，

以及，使可能含目标循环肿瘤细胞的液体样品于所述流道内流动，使目标循环肿瘤细胞与所述多肽结合，从而捕获目标循环肿瘤细胞。

进一步的，若所述液体样品为血液样品，则需将其中的红细胞去除后，再将所述液体样品输入所述芯片，并使所述液体样品于所述流道内流动。

在一实施方案之中，所述方法可以包括：通过在血液样品中加入红细胞裂解试剂而去除其中的红细胞。

在一更为具体的实施方案之中，一种利用靶向多肽在微流芯片中捕获循环肿瘤细胞的方 法可以包括如下步骤：

a)将血液样品进行红细胞裂解处理，实现肿瘤细胞的富集；

b)将循环肿瘤细胞特异性结合多肽连接于微流芯片内；

c)将处理过的血液样本流经微流芯片，进行循环肿瘤细胞的捕获。

与现有技术相比，本发明的优点包括：通过采用小分子量的靶向多肽捕捉循环肿瘤细胞，不仅可以实现不同类型细胞类的特异性捕捉，且因多肽的空间位阻小，其更易于与目标细胞上的靶分子充分接触并结合，同时多肽易于获取，可以为循环肿瘤细胞的检测提供了一个成本低廉且易于大规模生产的有效工具。

附图说明

图1是本发明一典型实施方案之中一种利用靶向多肽在微流芯片中捕获循环肿瘤细胞的原理图；

图2a-图2b是本发明一较佳实施方案之中的一种微流芯片内的流道结构示意图及流道的局部放大示意图；

图3a-图3b是本发明一实施例之中所捕获循环肿瘤细胞的显微图片。

具体实施方式

目前业界一般采用亲和力较高的抗体或适配体与微流芯片相结合来捕获细胞，但是其存在前文所述的诸多不足。然而，对于另一种能够特异性识别及结合细胞的物质，即多肽而言，长期以来研究人员一直认为其亲和力不够高因而不常采用。但是本案发明人经大量实践后意外发现，采用多肽，特别是能与相应循环肿瘤细胞特异性结合的靶向性多肽与微流芯片结合，其能实现对循环肿瘤细胞的高效、准确的捕捉，基于这一发现，本案发明人提出了本发明的技术方案。

下面通过结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

本实施例中的一种循环肿瘤细胞特异性结合多肽修饰的微流控芯片(亦可称为微流芯片或简称为芯片)的制作过程如下：

一、微流芯片的设计、制备及醛基化修饰

1、微流芯片的设计

芯片采用了弯曲流道设计来显著增加流体中细胞和流道捕捉表面的接触频率。请参阅图 2a中所示，在一较佳实施例中，微流芯片内分布有若干波浪形流道，其中，每一流道包含若干(例如15.5个)曲线形结构单元，再请参阅图2b，在每一结构单元中R为流道曲率，W为流道宽度，其中R优选为0.35mm，W优选为100μm，高度优选为35μm。

2、微流芯片的制备：在一实施例中，该微流芯片上层为盖片(材质可以为PDMS)，下层为载板，例如玻璃载玻片，两者通过不可逆键合完成封装。

在一更为具体的实施例中，微流芯片的盖片上的通道利用硅片模板浇注而成。硅片模板制作方法如下：将硅片进行氧洗，然后将菲林板贴在玻璃板上，吹净后涂上六甲基乙硅氧烷(HMDS)作用15min，以1500rad/min转速匀胶，前烘100℃6min，曝光27s后显影3min，冲洗后进行后烘110℃8min，最后进行深硅刻蚀，刻蚀厚度为35μm，获得PDMS块体。

将PDMS块体从模板上剥离下来，在PDMS块体通道两端用打孔器打出小孔后，再与清洗干净的载玻片分别置于PLASMA Cleaner(等离子表面处理仪)中，抽真空至仪器内气压为500mTorr，打开PLASMA作用8分钟；

将PDMS块体与载玻片贴合，并置于干燥箱90℃烘烤5分钟，使之永久键合，形成微流芯片。

3、微流芯片的醛基化修饰

1)在室温避光条件下向所述微流芯片内以10μL/min的流速通入2％(v/v)3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的乙醇溶液；

2)以10μL/min的流速通入乙醇溶液清洗20分钟；

3)以10μL/min的流速通入去离子水清洗30分钟；

4)将芯片中的液体吹干后置于干燥箱110℃烘烤60分钟；

5)待芯片冷却后以10μL/min的流速通入戊二醛反应液2小时(戊二醛反应液配制：50％戊二醛2.5mL，42.5mL PBS,氰基硼氢化钠0.1g,pH 7.4)；

6)以10μL/min的流速通入去离子水清洗30分钟，将芯片中的液体吹干后置于4℃保存。

二、循环肿瘤细胞特异性结合多肽的修饰

1)将0.5mM的A549细胞靶向多肽A-1(A-1多肽为通过筛选获得，见专利ZL201110340669.1)的PBS溶液通入微流道内，4℃孵育过夜；

2)以10μL/min的流速通入PBS清洗10分钟后，3％(w/v)BSA封闭1小时；

3)以10μL/min的流速通入PBS清洗10分钟后置于4℃备用。

在一实施例中，利用该芯片进行循环肿瘤细胞捕捉的方法包括：

1、样品处理

首先，将血液样本进行红细胞裂解。取1mL新鲜抗凝血，掺入10⁴个A549细胞，加入10mL红细胞裂解液(购自TBDscience，货号NH4CL2009)轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟。转速500g、4℃离心5分钟，弃红色上清。加入5mL PBS(磷酸盐缓冲液)重悬沉淀，500g 4℃离心3分钟，弃上清，重复1次，共洗涤2次，将细胞沉淀重悬于200μL PBS。通过此步骤达到一定程度的循环肿瘤细胞富集。

2、循环肿瘤细胞的捕获

请参阅图1所示是本实施例中循环肿瘤细胞捕获过程的示意图，其中，a为血液样本中的循环肿瘤细胞，b为血液样本中其它的有核细胞，c为聚二甲基硅氧烷PDMS的盖片,d为循环肿瘤细胞靶向多肽,e为微流控芯片下部的载玻片基片。

更为具体的，该过程可以包括：通过注射泵将处理过的血液样本注入所述微流控芯片，静置1分钟，使通入的细胞能与流道表面的多肽充分接触，然后通过注射泵控制，以1μL/min的流速通入PBS清洗5min。分别统计通入PBS清洗前后流道内的A549(GFP)细胞数，从而计算捕获效率。测试结果显示，在PBS清洗前后，A549(GFP)细胞的捕获率为71％。

又及，请参阅图3a所示为显微镜明场条件下清洗后被捕获下来的A549(GFP)细胞和T细胞，图3b所示为荧光与明场叠加的图，证明所捕获的细胞为A549细胞。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。