本发明涉及有机合成领域，具体地，涉及一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症严重威胁人类健康，抗肿瘤研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。分子生物学的迅速发展，人们对癌症发生发展机制有了进一步的认识，肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调控、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。
噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物是一类具有良好生物活性的稠杂环化合物，目前已有文献报道噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物具有抗菌、抗过敏、抗炎、抗滤过性病原体及除草等活性，并且噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物可作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂、Raf激酶抑制剂、血管表皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制剂、磷脂酰肌醇3(PI3K)小分子抑制剂、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂以及腺苷受体拮抗剂等，尤其是可用于治疗肿瘤，设计和合成新的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物并研究其活性具有广泛的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物，该噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物具有良好的抑制肿瘤细胞增殖活性。
为了实现上述目的，本发明提供了一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物，该噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物为式(1)所示结构的化合物：
其中，R1和R2各自独立地表示H或C1-6的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-8的脂肪环；
R3表示C1-6的卤代烷基；
R4表示H、卤素、C1-6的烷基或C1-6的烷氧基
本发明还提供了一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
1)在第一有机溶剂和第一碱存在下，使式(2)所示结构的化合物和CS2进行第一环化反应，得到式(3)所示结构的化合物；
2)在第二有机溶剂和第二碱存在下，使式(4)所示结构的化合物、丙二腈和硫进行第二环化反应，得到式(5)所示结构的化合物；
3)在第三有机溶剂的存在下，使式(5)所示结构的化合物、R3COOH和三卤氧磷进行环化卤代反应，得到式(6)所示结构的化合物；
4)在第四有机溶剂的存在下，使式(3)所示结构的化合物与式(6)所示结构的化合物进行取代反应，得到式(1)所示结构的化合物；
其中，R1和R2各自独立地表示H或C1-6的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-8的脂肪环；R3表示C1-6的卤代烷基；R4表示H、卤素、C1-6的烷基或C1-6的烷氧基；X表示卤素。
本发明还提供了上述噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物在制备抗癌药物中的应用。
通过上述技术方案，本发明提供的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物具有良好的体外抑制肿瘤细胞增殖活性，对人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞系MCF-7、人口腔上皮癌细胞株KB均具有明显的抑制作用，可用作抗肿瘤药物的活性成分。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物，该噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物为式(1)所示的化合物：
其中，R1和R2各自独立地表示H或C1-6的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-8的脂肪环；R3表示C1-6的卤代烷基；R4表示H、卤素、C1-6的烷基或C1-6的烷氧基
在本发明中，在中的-R4表示其取代位置可以是任意的，例如可以为邻位、对位或间位。另外，在本发明中，与相同的表示方式也表示相同的意思，也即基团的取代位置可以是任意的。
在本发明中，所述C1-6的烷基可以是直链的，也可以是支链的。所述C1-6的烷基的实例可以包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基。这些基团中，优选为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
在本发明中，所述C1-6的卤代烷基可以为至少一个H被卤素取代的上述C1-6的烷基，卤素可以为F、Cl、Br和I中的一种或多种。作为C1-6的卤代烷基的实例可以包括但不限于：一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、全氟乙基、全氟丙基、全氟丁基、全氟戊基、全氟己基、一氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、一氯乙基、二氯丙基、三氯乙基，全氯乙基、全氯丙基、全氯丁基、全氯戊基、全氯己基、一溴甲基、二溴甲基、三溴甲基、三溴乙基、全溴乙基、全溴丙基、全溴丁基、全溴戊基、 全溴己基。
在本发明中，所述C1-3的烷基可以是直链的，也可以是支链的。所述C1-3的烷基的实例可以包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基，优选为甲基或乙基。
在本发明中，所述C1-3的卤代烷基可以为至少一个H被卤素取代的上述C1-3的烷基，卤素为F、Cl、Br和I中的一种或多种。作为C1-3的卤代烷基的实例可以包括但不限于：一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、全氟乙基、全氟丙基、一氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、一氯乙基、二氯丙基、三氯乙基，全氯乙基、一溴甲基、二溴甲基、三溴甲基、三溴乙基、全溴乙基、全溴丙基。
在本发明中，所述C1-6的烷氧基中的C1-6的烷基与上述“C1-6的烷基”相同。具体地，可以举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、己氧基等。
在本发明中，所述C1-3的烷氧基中的C1-3的烷基与上述“C1-3的烷基”相同。具体地，可以举出甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
在本发明中，所述C5-8的脂肪环可以为五元脂肪环、六元脂肪环、七元脂肪环或八元脂肪环，可以是饱和的或不饱和的，可以具有或不具有侧链，优选为饱和脂肪环，更优选为不具有侧链的饱和脂肪环，进一步优选为不具有侧链的饱和五元脂肪环或饱和六元脂肪环。
在本发明中，所述卤素为F、Cl、Br或I。
根据本发明，优选地，R1和R2各自独立地表示H或C1-3的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示C1-3的卤代烷基；R4表示H、卤素、C1-3的烷基或C1-3的烷氧基。
更优选地，R1和R2各自独立地表示H、甲基或乙基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示二氟甲基或三氟甲基；R4为F、Cl、Br、 甲氧基或乙氧基。
进一步优选地，R1表示H或乙基，R2表示甲基或乙基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示三氟甲基；R4为Cl或甲氧基。
在本发明中，作为特别优选的所述噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物的具体例子，可以举出下述式(1-1)～式(1-7)所示结构的化合物，
本发明还提供了制备上述噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物的方法，该方法包括以下步骤：
1)在第一有机溶剂和第一碱存在下，使式(2)所示结构的化合物和CS2进行第一环化反应，得到式(3)所示结构的化合物；
2)在第二有机溶剂和第二碱存在下，使式(4)所示结构的化合物、丙 二腈和硫进行第二环化反应，得到式(5)所示结构的化合物；
3)在第三有机溶剂的存在下，使式(5)所示结构的化合物、R3COOH和三卤氧磷进行环化卤代反应，得到式(6)所示结构的化合物；
4)在第四有机溶剂的存在下，使式(3)所示结构的化合物与式(6)所示结构的化合物进行取代反应，得到式(1)所示结构的化合物；
其中，R1和R2各自独立地表示H或C1-6的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-8的脂肪环；R3表示C1-6的卤代烷基；R4表示H、卤素、C1-6的烷基或C1-6的烷氧基；X表示卤素。
根据本发明的方法，优选地，R1和R2各自独立地表示H或C1-3的烷基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示C1-3的卤代烷基；R4表示H、卤素、C1-3的烷基或C1-3的烷氧基；X为Cl或Br。
更优选地，R1和R2各自独立地表示H、甲基或乙基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示二氟甲基或三氟甲基；R4为F、Cl、Br、甲氧基或乙氧基；X为Cl或Br。
进一步优选地，R1表示H或乙基，R2表示甲基或乙基，或者R1和R2相互键合形成C5-6的脂肪环；R3表示三氟甲基；R4为Cl或甲氧基；X为Cl。
根据本发明的方法，上述方法能够制得前文描述的式(1)所示结构的化合物，为此，这里的取代基R1-R4，可以根据前文中描述的式(1)所示的化合物的取代基R1-R4进行适当地选择，对于具体基团的描述可以参考上文中的描述，在此不再赘述。
下面对本发明的方法的各步骤分别进行说明。
步骤1)
根据本发明的制备方法，在步骤1)中，通过在第一有机溶剂和第一碱存在下，使式(2)所示结构的化合物和CS2进行第一环化反应，得到式(3)所示结构的化合物。
作为式(2)所示结构的化合物的具体例子，例如可以举出邻氯苯甲酰肼、2-甲氧基苯甲酰肼、3-甲氧基苯甲酰肼或4-甲氧基苯甲酰肼。
作为所述第一溶剂，只要能够溶解反应原料，且在步骤1)的反应条件下难以与反应原料反应即可，作为这样的第一溶剂优选为甲醇、乙醇和二甲基亚砜中的一种或多种。
作为所述第一溶剂的用量，只要能够使第一环化反应顺利进行即可，可以为本领域的常规用量。例如，相对于1重量份(2)所示结构的化合物，所述第一溶剂的用量可以为4-80重量份，优选为10-60重量份。
作为所述第一碱可以为本领域所公知的各种无机碱，优选为碱金属氢氧化物和碱金属碳酸盐中的一种或多种；更优选为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾和碳酸钠中的一种或多种；进一步优选为氢氧化钾和/或氢氧化钠。
在步骤1)中，CS2的用量可以根据式(2)所示结构的化合物进行选择。优选地，式(2)所示结构的化合物和CS2的摩尔比可以为1:1-4，优选为1:1.1-3，更优选为1:1.2-2。
在步骤1)中，所述第一碱的用量可以在较大范围内进行选择。优选地，式(2)所示结构的化合物和所述第一碱的摩尔比为1:1-3，优选为1:1-2，更 优选为1:1.1-1.5。
在步骤1)中，对于所述第一环化反应的条件没有特别的限定，可以为本领域的常规条件，优选地，所述第一环化的条件包括：反应温度为60-100℃(更优选为70-80℃)，反应时间为3-48小时(更优选为6-20小时)。
在所述第一环化反应结束后，可以采用本领域常规的方法对反应产物进行纯化。例如可以通过减压蒸去部分溶剂后进行冷却，将所得固体溶解于水中、过滤，滤液用浓盐酸等酸调节至酸性(例如pH为1-2)，使大量固体析出，过滤固体，并进行重结晶来得到式(3)所示结构的化合物。
步骤2)
根据本发明的制备方法，在步骤2)中，通过在第二有机溶剂和第二碱存在下，使式(4)所示结构的化合物、丙二腈和硫进行第二环化反应，得到式(5)所示结构的化合物。
作为式(4)所示结构的化合物的具体例子，例如可以举出正丁醛、3-戊酮、环戊酮或环己酮。
作为所述第二溶剂，只要能够溶解反应原料，且在步骤2)的反应条件下难以与反应原料反应即可，作为这样的第二溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、乙腈和四氢呋喃中的一种或多种。
作为所述第二溶剂的用量，只要能够使第二环化反应顺利进行即可，可以为本领域的常规用量。例如，相对于1重量份(4)所示结构的化合物，所述第二溶剂的用量可以为2-30重量份，优选为3-10重量份。
作为所述第二碱可以为本领域所公知的各种无机碱和有机碱，优选为碱金属碳酸盐、碱金属氢氧化物和有机胺中的一种或多种；更优选为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、三乙胺、二乙胺、吗啡啉和哌啶中的一种或多种；进一步优选为碳酸钾、三乙胺。
在步骤2)中，丙二腈和硫的用量可以根据式(4)所示结构的化合物进 行选择。优选地，式(4)所示结构的化合物、丙二腈和硫的摩尔比为1:1-1.5:1-1.8，优选为1:1-1.3:1-1.5，更优选为1:1-1.2:1-1.3。
在步骤2)中，所述第二碱的用量可以在较大范围内进行选择。优选地，式(4)所示结构的化合物和所述第二碱的摩尔比为1:0.1-3，优选为1:0.2-1.5，更优选为1:0.2-0.8。
在步骤2)中，对于所述第二环化反应的条件没有特别的限定，可以为本领域的常规条件，优选地，所述第二环化的条件包括：反应温度为0-100℃(更优选为0-80℃)，反应时间为0.5-16小时(更优选为2-16小时，进一步优选为4-8小时)。
在所述第二环化反应结束后，可以采用本领域常规的方法对反应产物进行纯化。例如可以将反应液加入到不良溶剂(优选为冰水)中使固体析出，过滤固体后进行干燥来得到式(5)所示结构的化合物。
步骤3)
根据本发明的制备方法，在步骤3)中，通过在第三有机溶剂的存在下，使式(5)所示结构的化合物、R3COOH和三卤氧磷进行环化卤代反应，得到式(6)所示结构的化合物。
作为式R3COOH的具体例子，例如可以举出二氟乙酸或三氟乙酸。
作为三卤氧磷的具体例子，例如可以举出三氯氧磷或三溴氧磷。
作为所述第三溶剂，只要能够溶解反应原料，且在步骤3)的反应条件下难以与反应原料反应即可，作为这样的第三溶剂优选为甲苯、二甲苯和1,4-二噁烷中的一种或多种。
作为所述第三溶剂的用量，只要能够使环化卤代反应顺利进行即可，可以为本领域的常规用量。例如，相对于1重量份式(5)所示结构的化合物，所述第三溶剂的用量可以为1-20重量份，优选为3-10重量份。
在步骤3)中，R3COOH和三卤氧磷的用量可以根据式(5)所示结构的化合物进行选择。优选地，式(5)所示结构的化合物、R3COOH和三卤 氧磷的摩尔比为1:1-2:1.3-5，优选为1:1-1.5:1.5-3，更优选为1:1-1.2:2-3。
在步骤3)中，对于所述环化卤代反应的条件没有特别的限定，可以为本领域的常规条件，优选地，所述环化卤代反应包括：反应温度为60-100℃(更优选为70-90℃)，反应时间为3-24小时(更优选为6-12小时)。
在所述环化卤代反应结束后，可以采用本领域常规的方法对反应产物进行纯化。例如可以通过减压蒸去所述第三溶剂和三卤氧磷后，进行萃取、洗涤和干燥来得到式(6)所示结构的化合物。
步骤4)
根据本发明的制备方法，在步骤4)中，通过在第四有机溶剂的存在下，使式(3)所示结构的化合物与式(6)所示结构的化合物进行取代反应，得到式(1)所示结构的化合物。
作为所述第四溶剂，只要能够溶解反应原料，且在步骤1)的反应条件下难以与反应原料反应即可，作为这样的第二溶剂优选为乙腈、四氢呋喃、丙酮和DMF中的一种或多种。
作为所述第四溶剂的用量，只要能够使取代反应顺利进行即可，可以为本领域的常规用量。例如，相对于1重量份(3)所示结构的化合物，所述第四溶剂的用量可以为3-20重量份，优选为5-15重量份。
根据本发明的方法，优选的情况下，所述取代反应在第三碱催化下进行，作为所述第三碱可以为本领域所公知的各种无机碱，优选为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、有机胺中的一种或多种；更优选为氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、三乙胺中的一种或多种。
上述第三碱的用量可以在较大范围内进行选择。优选地，式(3)所示结构的化合物和所述第三碱的摩尔比为1:0.1-3，优选为1:0.2-1.5，更优选为1:0.3-1。
在步骤4)中，式(6)所示结构的化合物的用量可以根据式(3)所示结构的化合物进行选择。优选地，式(3)所示结构的化合物和式(6)所示结构的化合物的摩尔比为1:1-1.5，优选为1:1-1.3，优选为1:1-1.2。
在步骤4)中，对于所述取代反应的条件没有特别的限定，可以为本领域的常规条件，优选地，所述取代反应的条件包括：反应温度为50-100℃(更优选为70-85℃)，反应时间为1-12小时(更优选为2-6小时)。
在所述取代反应结束后，可以采用本领域常规的方法对反应产物进行纯化。例如可以在除去溶剂后对得到的粗产物进行柱色谱或重结晶分离来得到式(1)所示结构的化合物。
本发明还提供了本发明的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物在制备抗癌药物中的应用。
优选地，本发明还提供了本发明的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物在制备治疗肝癌、乳腺癌或口腔上皮癌的药物中的应用。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。
以下实施例中，1H NMR和13C NMR采用BRUKER Avance 400型超导核磁共振仪测试。EI-MS采用Agilent 5975inert质谱仪进行测试。
以下实施例采用的合成如下：
实施例1
步骤1)：5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇(式(3-1))的制备
向150mL圆底烧瓶中加入1.40g(0.025mol)KOH、60mL无水乙醇，常温搅拌，30min后加入3.41g(0.020mol)邻氯苯甲酰肼。升温至40℃，缓慢滴加2.13g(0.028mol)CS2的乙醇溶液，10min加完，继续反应40min。然后在80℃下反应10h。反应完毕，减压蒸去部分溶剂、冷却，所得固体溶解于40mL蒸馏水中。过滤，滤液用浓盐酸调节至pH＝1，有大量固体析出。抽滤、水洗、干燥后，通过无水乙醇重结晶得到5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇(浅黄色固体，产率为68％)。
步骤2)：2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈(式(5-1))的制备
将3.5g(0.11mol)单质硫、7.2g(0.10mol)正丁醛和10mL的DMF加入到150mL三颈烧瓶中，冰浴下缓慢滴加10mL三乙胺，1h加完。再滴加6.6g(0.10mol)丙二腈的DMF溶液，保持温度不超过35℃。1h加完，常 温搅拌30min。反应结束后，将反应液加入到500mL冰水中，有大量黄色固体析出。抽滤、水洗、减压干燥即得到2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈(黄色固体，产率67％)。
步骤3)：6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(式(6-1))的制备
将3.04g(0.020mol)2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈、2.51g(0.022mol)三氟乙酸、4mL新蒸的三氯氧磷和15mL甲苯加入50mL圆底烧瓶中。80℃反应12h，TLC监控(展开剂：V石油醚:V乙酸乙酯＝3:1)至反应完全。反应结束后，减压蒸去甲苯和三氯氧磷。冷却后，加入50g碎冰，用30mL(3×10mL)乙酸乙酯萃取，冷的饱和碳酸氢钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥。然后减压浓缩得到6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(褐色油状液体，产率63％)。
步骤4)：式(1-1)所示结构的化合物的制备
将0.53g(0.002mol)6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶、0.43g(0.002mol)5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇、0.2g碳酸钾和8mL乙腈加入25mL圆底烧瓶中，80℃反应2h。反应结束后，减压浓缩。所得固体用蒸馏水洗涤，过滤、干燥得浅黄色固体。柱色谱分离(Al2O3，展开剂：V乙酸乙酯:V石油醚＝1:2)得到式(1-1)所示结构的化合物(白色晶体，产率79％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.99～7.41(m,4H,Ar-H),7.12(s,1H, thienyl H),3.07(q,J＝8Hz,2H,CH3CH2-),1.45(t,J＝8Hz,3H,CH3CH2-)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:167.13,157.66,156.59,154.92,150.19(q,2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),133.53,133.00,131.36,131.27,129.88,127.18,122.71,120.71(q,1JF-C＝274Hz,CF3),116.55,113.79,24.87,14.94.
EI-MS m/z:442.15(M+)。
实施例2
步骤1)：5-(4-甲氧基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇(式(3-2))的制备
向150mL圆底烧瓶中加入1.40g(0.025mol)KOH、60mL无水乙醇，常温搅拌，30min后加入3.32g(0.020mol)4-甲氧基苯甲酰肼。升温至40℃，缓慢滴加2.13g(0.028mol)CS2的乙醇溶液，10min加完，继续反应40min。然后在80℃下反应6～10h。反应完毕，减压蒸去部分溶剂、冷却，所得固体溶解于40mL蒸馏水中。过滤，滤液用浓盐酸调节至pH＝1，有大量固体析出。抽滤、水洗、干燥后，无水乙醇重结晶得到5-(4-甲氧基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇(浅黄色固体，产率为71％)。
步骤2)：与实施例1的步骤2)相同；
步骤3)：与实施例1的步骤3)相同；
步骤4)：式(1-2)所示结构的化合物的制备
除了将实施例1的步骤4)中的5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇替换为5-(4-甲氧基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇以外，与实施例1的步骤4)同样地进行，得到式(1-2)所示结构的化合物(白色固体，产率83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.02～7.01(m,4H,Ar-H),7.12(s,1H,thienyl H),3.89(s,3H,-OCH3),3.07(q,J＝8Hz,-CH2CH3),1.44(t,J＝8Hz,-CH2CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:168.71,166.97,162.93,157.95,155.03,154.79,149.95(q,2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),129.77,129.01,120.72(q,1JF-C＝274Hz,CF3),115.69,114.66,113.79,55.50,24.84,14.91。
EI-MS m/z:438.22(M+)。
实施例3
步骤1)：采用与实施例2的步骤1)相同的方法制备5-(4-甲氧基苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇；
步骤2)：2-氨基-5-甲基-4-乙基噻吩-3-腈(式(5-2))的制备
将8.6g(0.10mol)3-戊酮、6.6g(0.10mol)丙二腈、3.5g(0.11mol)单质硫、2.8g(0.02mol)K2CO3和150mL无水乙醇加入到250mL圆底烧瓶中。回流反应3h。反应完毕，减压蒸去部分溶剂、冷却后加入到500mL冰水中，抽滤、水洗3次、无水乙醇重结晶，得到2-氨基-5-甲基-4-乙基噻吩-3-腈(浅黄色固体，产率78％)。
步骤3)：6-甲基-5-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶(式(6-2))的制备
采用实施例1的步骤3)的方法进行，不同的是，将2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈替换为2-氨基-5-甲基-4-乙基噻吩-3-腈，相同地得到式(6-2)所示结构的化合物(产率62％)；
步骤4)：式(1-3)所示结构的化合物的制备
除了将实施例2的步骤4)中的6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶替换为6-甲基-5-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶以外，与实施例2的步骤4)同样地进行，得到式(1-3)所示结构的化合物(白色固体，产率84％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.06～7.03(m,4H,Ar-H),3.90(s,3H,-OCH3),3.09(q,J＝8Hz,2H,-CH2CH3),2.63(s,3H,6-CH3),1.38(t,J＝8Hz,3H,-CH2CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:168.90,166.48,162.90,158.70,155.02,149.16(q,2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),139.78,131.13,129.35,129.01,120.68(q,1JF-C＝274Hz,CF3),115.82,114.64,55.49,21.18,15.49,13.96.
EI-MS m/z:452.26(M+)。
实施例4
步骤1)：除了将实施例1的步骤1)中的邻氯苯甲酰肼替换为2-甲氧基苯甲酰肼以外，与实施例1的步骤1)同样地进行，得到式(3-3)所示结构的化合物(产率67％)；
步骤2)：除了将实施例3的步骤2)中的3-戊酮替换为环戊酮以外，与 实施例3的步骤2)同样地进行，得到式(5-3)所示结构的化合物(产率81％)；
步骤3)：除了将实施例1的步骤3)中的2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈替换为式(5-3)所示结构的化合物以外，与实施例1的步骤3)同样地进行，得到式(6-3)所示结构的化合物(产率65％)；
步骤4)：除了将实施例1的步骤4)中的6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶和5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇分别替换为式(6-3)所示结构的化合物和式(3-3)所示结构的化合物以外，与实施例1的步骤4)同样地进行，得到式(1-4)所示结构的化合物(产率77％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.95～7.06(m,2H,Ar-H),3.94(s,3H,-OCH3),3.23(t,J＝8Hz,2H,7-CH2),3.15(t,J＝8Hz,2H,5-CH2),2.64(m,2H,6-CH2)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:171.83,167.66,158.17,158.08,155.39,149.34(q,2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),148.63,135.56,133.73,130.66,125.91,120.81,120.73(q,1JF-C＝273Hz,CF3),112.48,112.05,56.01,30.42,29.20,27.82。
EI-MS m/z:450.19(M+)。
实施例5
步骤1)：除了将实施例1的步骤1)中的邻氯苯甲酰肼替换为3-甲氧基苯甲酰肼以外，与实施例1的步骤1)同样地进行，得到式(3-4)所示结构的化合物(产率68％)；
步骤2)：与实施例4的步骤2)相同；
步骤3)：与实施例4的步骤3)相同；
步骤4)：除了将实施例1的步骤4)中的6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶和5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇分别替换为式(6-3)所示结构的化合物和式(3-4)所示结构的化合物以外，与实施例1的步骤4)同样地进行，得到式(1-5)所示结构的化合物(产率81％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.69～7.12(m,4H,Ar-H),3.90(s,3H,-OCH3),3.25(t,J＝8Hz,2H,7-CH2),3.18(t,J＝8Hz,2H,5-CH2),2.66(m,2H,6-CH2)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:171.90,168.72,160.06,157.72,155.76,149.32(q,2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),148.81,135.48,130.33,125.87,124.36,120.71(q,1JF-C＝273Hz,CF3),119.59,119.15,111.51,55.51,30.43,29.19,27.83。
EI-MS m/z:450.20(M+)。
实施例6
步骤1)：与实施例2的步骤1)相同；
步骤2)：与实施例4的步骤2)相同；
步骤3)：与实施例4的步骤3)相同；
步骤4)：除了将实施例1的步骤4)中的6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶和5-(2-氯苯基)-1,3,4-噁二唑-2-硫醇分别替换为式(6-3)所示结构的化合物和式(3-2)所示结构的化合物以外，与实施例1的步骤4)同样地进行，得到式(1-6)所示结构的化合物(产率85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.02～7.00(m,4H,Ar-H),3.87(s,3H,-OCH3),3.22(t,J＝8Hz,2H,7-CH2),3.15(t,J＝8Hz,2H,5-CH2),2.62(m,2H,6-CH2)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:171.84,168.75,162.90,157.98,154.93,149.33(q,2JF-C＝37Hz,pyrimidyl 2-C),148.68,135.51,128.99,125.83,120.71(q,1JF-C＝274Hz,CF3),115.76,114.64,55.50,30.42,29.20,27.82。
EI-MS m/z:450.19(M+)。
实施例7
步骤1)：与实施例2的步骤1)相同；
步骤2)：除了将实施例3的步骤2)中的3-戊酮替换为环己酮以外，与实施例3的步骤2)同样地进行，得到式(5-4)所示结构的化合物(产率94％)；
步骤3)：除了将实施例1的步骤3)中的2-氨基-5-乙基噻吩-3-腈替换为式(5-4)所示结构的化合物以外，与实施例1的步骤3)同样地进行，得 到式(6-4)所示结构的化合物(产率70％)；
步骤4)：除了将实施例2的步骤4)中的6-乙基-2-三氟甲基-4-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶替换为式(6-4)所示结构的化合物以外，与实施例2的步骤4)同样地进行，得到式(1-7)所示结构的化合物(产率86％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.05～7.03(m,4H,Ar-H),3.90(s,3H,-OCH3),3.16(m,2H,8-CH2),2.97(m,2H,5-CH2),2.02(m,4H,6-&7-CH2)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:168.81,166.84,162.88,158.85,155.06,149.45(q, 2JF-C＝38Hz,pyrimidyl 2-C),142.79,129.22,128.99,126.66,120.67(q,1JF-C＝273Hz,CF3),115.82,114.64,55.50,26.09,25.92,22.26,22.22。
EI-MS m/z:464.16(M+)。
测试例1：部分化合物体外抗肿瘤活性测试
人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人口腔上皮癌细胞株KB购于中国医学科学院基础医学研究所，分别采用含10％FBS的DMEM培养基、含10％FBS的DMEM培养基、含10％FBS的IMDM培养基培养。
用上述式(1-1)至(1-7)(表格中记载为1-1～1-7)所示的化合物按如下方法进行MTT实验，以索拉菲尼为阳性对照药，并进行结果分析，初步的测试结果如表1所示。
1)收集对数生长期细胞，调整细胞悬浮液浓度，每孔加入50μL密度为 5000-7500细胞/孔；
2)在37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜，加入不同浓度的药物，每个药物设9个浓度梯度(分别为30μmol/L、10μmol/L、3.33μmol/L、1.11μmol/L、0.37μmol/L、0.123μmol/L、0.041μmol/L、0.0137μmol/L和0μmol/L)，每孔50μL，每个浓度设2个重复。
3)在5％CO2、37℃条件下培养72小时；
4)去除培养基，每孔加入100μL无血清培养基配制的终浓度为1mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时；
5)每孔加入Lysis Buffer(25％SDS+50％DMF)100μL，37℃孵育过夜；
6)用Synergy 4多功能读板机于570nm处读取各孔的吸光值；
7)计算IC50值。各样品的IC50曲线用GraphPad Prism 5软件分析，样品对肿瘤细胞生长的抑制百分比＝(样品孔OD值-空白孔OD均值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD均值)×100％。实验结果见表1。
表1
通过上表1的数据可以看出，本发明提供的噻吩并[2,3-d]嘧啶类化合物 对HepG2、MCF-7和KB细胞株均具有明显的抑制作用。特别是化合物1-2、1-3、1-6和1-7对HepG2细胞株的抑制作用极其显著；化合物1-2、1-3、1-4、1-6和1-7对MCF-7细胞株的抑制作用极其显著；化合物1-2、1-3、1-6和1-7对KB细胞株的抑制作用极其显著。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。