产挥发性的抑菌、杀线虫活性成分的裂褶菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及裂褶菌(Schizophyllum commune)，尤其一株产生挥发性的抑菌、杀线虫有机活性成分的裂褶菌菌株，本发明进一步涉及由该裂褶菌制备的生防制剂及其在防控危害植物生长的真菌、细菌或线虫等方面的应用，属于裂褶菌的分离和应用领域。

背景技术：

土壤中存在大量的危害植物生长的有害生物，例如有害真菌、细菌、寄生线虫等，这些有害生物的存在严重危害了植物的生长。

化学药剂的熏蒸在植物病虫害防治方面效果显著，其中溴甲烷是常用的熏蒸剂，对有害生物毒性高、穿透性能好、扩散迅速，在过去一段时间被广泛使用。但是，溴甲烷的大量使用会破坏臭氧层，导致严重危害到地球环境和人类健康，化学药剂的大量使用引起的危害人畜健康和环境污染等问题也日益受到人们的关注和重视，世界各国均在致力于开发高效、低毒、广谱和低残留的生物药剂来适应农林业的发展和国际贸易的需求。利用微生物代谢物代替化学药剂进行有害生物的防治，既能避免对人畜健康和环境污染等问题，又能有效降低农药残留。

裂褶菌(Schizophyllum commune)又称自参、树花，属于真菌门，担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、裂褶菌科、裂褶菌属。裂褶菌广布于世界各地，中国大部分地区都有分布。目前，裂褶菌的研究表明：其能产生含有多种抗菌消炎、抗肿瘤，抗辐射等活性物质。但是裂褶菌是否能产生挥发性抑菌气体的研究较少。因此筛选到一株能产生挥发性抑菌气体的裂褶菌在生物防治危害植物的细菌性病害、真菌性病害或寄生线虫等方面将具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一株从杨树中分离得到的能产生挥发性抑菌、杀虫活性成分的裂褶菌菌株；

本发明的目的之二是将所分离的裂褶菌菌株制备成生防制剂应用于防控危害植物生长的细菌、真菌或线虫等病虫害。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明将采集到的杨树树叶通过消毒、接种、分离、纯化、鉴定，最终分离得到了一株能产生挥发性有机成分的裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)；本发明将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12772；分类命名为：裂褶菌Schizophyllum commune；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年7月7日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所分离的裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)能产生抑菌、杀虫挥发性活性成分。利用HP-5MS型毛细管柱来分离挥发性气体，通过比较质谱仪中NIST MS Search 2.0数据库来鉴定挥发性物质，结果共鉴定出了16种有效成分，其中，以β-红没药醇(β-bisabolol)为主要成分。

本发明还提供了所述裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)在制备抑制细菌、卵菌或真菌的药物或制剂中的应用。

其中，所述细菌包括：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；所述真菌包括：杨树烂皮病菌(Valsa sordida)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)、杨树褐斑病菌(Marssonina brunnea)、火木层孔菌(Phellinus igniarius)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、链格孢(Alternaria alternata)、松树枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)：所述卵菌包括：腐霉(Pythium sp)疫霉菌(Phytophthora sp)。

本发明用裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)所产生的挥发性成分分别对卵菌，子囊菌，担子菌和细菌中的16种常见病原菌进行了抑菌试验。抑菌试验结果表明，裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)对杨树烂皮病菌(Valsa sordida)，稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)和杨树褐斑病菌(Marssonina brunnea)在48H时的抑制率达到100％，96H时的抑制率仍然很高；对火木层孔菌(Phellinus igniarius)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)和链格孢(Alternaria alternata)48H和96H的抑制率都达到90％以上；松树枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在48H时的抑制率达到70％以上，在96H时对松树枯梢病菌的仍然在70％以上，但是根癌农杆菌的抑制率下降到37.92％。

通过对松材线虫的抑制试验表明，本发明裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的挥发性产物对线虫的虫和卵都有一定的抑制率。因此，本发明裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)可以应用于制备杀线虫药物或制剂，其中，所述线虫优选为松材线虫。

因此，可以将本发明的裂褶菌菌株制备成保鲜剂或生物熏蒸剂应用于果蔬贮藏或运输中的杀菌或保鲜，譬如，将本发明的裂褶菌菌株进行扩大培养后获得的菌剂直接作为保鲜剂(也可向所制备的裂褶菌菌剂中加入一定量的适宜载体得到生物熏蒸剂)加入到待贮藏或运输的果蔬中，所产生的挥发性成功能够有效抑制果蔬中的各种细菌、真菌或线虫，达到果蔬保鲜的效果；或者将本发明的裂褶菌菌株按照本领域的常规方法制备成生物熏蒸剂用于防治温室、大棚中果蔬病虫害或应用于杀灭土传细菌、真菌或植物寄生线虫；譬如，将所述裂褶菌菌株进行扩繁培养后将其培养物与载体混合均匀，用于土壤或种子的消毒处理，能有效防控危害植物生长的各种细菌性、真菌性病害以及植物寄生线虫。

其中，将裂褶菌菌株进行扩繁培养时所用到的培养基可以是PDA培养基；所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸秆或干燥的农家肥等；此外，本发明的生物熏蒸剂中还可加入辅料或助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是稳定剂等。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明所分离的裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)能产生挥发性气体，该气体具有抑菌、杀菌的活性，能有效抑制细菌或真菌的生长；所产生的挥发性气体还具有杀线虫的效果，可作为生物熏蒸剂用于杀灭危害植物生长的各种土传细菌、真菌或植物寄生线虫。

附图说明

图1为本发明所分离的裂褶菌的抑菌情况：左为内生菌，右为病原菌；

图2为分析本发明所分离的裂褶菌的挥发性成分的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验例1 裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的分离与分类地位的鉴定

1.分离和鉴定方法

将采集到的杨树树叶表皮去掉，剪成2mm²大小的组织块，用2％次氯酸钠及75％的乙醇对组织进行表面消毒，将已消毒的组织块放入无菌水中清洗后接种到提前准备好的水琼脂培养基中；将分离得到的菌株在PDA培养基上进行纯化培养，纯化后的菌株进行菌种保藏；将长有菌丝的培养基切成5mm²的小块，然后放入经过三次高压灭菌的盛有无菌水的冷藏管中，密封，放入4℃保存。

用改进后的CTAB法提取得到菌株的DNA：将培养基上的菌丝刮下来放入无菌的1.5mL离心管中放入-20℃冷藏，然后再拿出来解冻，这样反复冻融3-5次；用真菌通用引物ITS1/4、ScRas1、ScTef1、ScAkt1和ScUbi 5对引物(表1)进行PCR扩增，将PCR产物送到测序公司测序,扩增序列分别递交到NCBI数据库获得相应序列号为：KU845337、KU845329、KU845332、KU845326和KU845335利用测序后得到的序列构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

表1 PCR引物及其序列

2.鉴定结果

由于菌株不产生孢子，因此只能通过分子手段确定其分类地位。通过5个基因位点的PCR序列在NCBI中blast的结果如表2所示，确定了所分离的裂褶菌菌株的OTU种，为Schizophyllum commune。5个基因位点序列通过NCBI基因库审查获得正式编号。并将得到的菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12772；分类命名为：Schizophyllum commune；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年7月7日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

表2 Blast结果

实验例2 裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的挥发性产物定性分析

1.分析方法

将裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)菌种接种到PDA培养基上，每个菌种重复三次；放在恒温培养箱里，培养时间为5天。

GC-MS检测挥发性气体，用HP-5MS型毛细管柱(涂层：(5％苯基)-甲基聚硅氧烷，30.0m×0.25mm，涂层厚度：0.25μm)来分离挥发性气体，氮气为载气。毛细管柱升温程序如下：33℃维持2min,再以7℃/min的速率升温至220℃维持7min。质谱扫描速率为:5.0000scans/s。质谱范围41-560amu(原子质量单位，atomic mass unit)。通过比较质谱仪中NIST MS Search 2.0数据库来鉴定挥发性物质。

萃取步骤：萃取头老化(气相法)老化的温度分别为柱温150℃，后进样口250℃，前检测器200℃，老化时间10min；萃取：用电钻在培养皿的侧面打孔，放在支架上，将老化后的萃取针平行插入，将萃取头调出，萃取时间为40min；进样：当离子元温度为150℃，压力为70时就可以进样，将萃取头调回，从顶空瓶中取出，插入进样孔中，然后将萃取头调出，停留大概40s后拔出萃取头；将分析的结果保存在电脑里。

2.分析结果

通过GC-MS分析了裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的特殊挥发性成分，从质谱图(图2)中可以看到16种有效成分如表3。从图2和表3的数据可见，裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)所产生的主要挥发性有机成分为β-红没药醇(β-bisabolol)。

表3 有效挥发性成分

试验例3 裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的抑菌和杀线虫试验

1试验方法

1.1内生菌&病原微生物

将9cm的PDA培养基中间除去2cm宽的培养基，形成两个半月形，将直径为0.5cm大小裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)菌块接种在培养基其中的一边培养5天后，再将直径为0.5cm大小病原菌菌块接种在培养基的另一边两天后开始记录病原真菌的菌落生长直径，细菌则为0.1cm大小的菌落接种。

1.2内生菌&松材线虫

将裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)和适合松材线虫生长的菌同时接种到分割好的PDA培养基中，在25℃下培养5天，然后在灰葡萄孢一侧接种50μL已知浓度的松材线虫，3天后用2ml的无菌水将松材线虫洗下来，利用显微镜确定松材线虫虫和卵的浓度。没有内生菌的为对照组，并做同样处理，最后计算内生菌对松材线虫的抑制率。

2试验结果

2.1抑菌结果

裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的挥发性成分分别对卵菌，子囊菌，担子菌，半知菌和细菌中的16种常见病原菌进行了抑菌试验。

试验结果见表4。从试验结果可见，裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)菌株对杨树烂皮病菌(Valsa sordida)，稻瘟病菌(Magn aporthe grisea)，木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)和杨树褐斑病菌(Mars sonina brunnea)在48H时的抑制率达到100％，96H时的抑制率仍然很高；对火木层孔菌(Phellinus igniarius),灰霉病菌(Botrytis cinerea)和链格孢(Alternaria alternata)48H和96H的抑制率都达到90％以上；松树枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在48H时的抑制率达到70％以上，在96H时对松树枯梢病菌的仍然在70％以上，但是根癌农杆菌的抑制率下降到37.92％。

表4 FPYF3010抑菌结果

*——：数据不可获得。

2.2抑制线虫试验结果

通过对线虫的抑制试验表明，裂褶菌菌株(Schizophyllum commune FPYF3010)的挥发性产物对线虫的虫和卵都有一定的抑制率，但是对虫的抑制率达到62.79％，对卵的抑制率仅为32.54％。

表5 本发明所分离的菌株对线虫的抑制结果