利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法及应用与流程

本发明涉及一种利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法及应用，属于微生物制品领域。

背景技术：

微生物絮凝剂是由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物，包括糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素等物质，它可以使水中不易降解的固体悬浮颗粒和胶体颗粒等絮凝、沉淀的特殊高分子代谢产物，是一种高效、安全、能自然降解的新型水处理剂。从其来源看，属于天然有机高分子絮凝剂，因此它具有天然有机高分子絮凝剂的一切优点。目前，絮凝剂的研究工作已由提纯、改性进入到利用生物技术培育、筛选优良的菌种，以较低的成本获得高效的絮凝剂的研究。微生物絮凝剂高效、无毒、无二次污染，因此是一类极具发展前途的水处理药剂。生物絮凝剂已经在环保、化工等领域得到较广泛的应用，并且愈来愈受到人们的青睐。与常见的无机絮凝剂和有机合成高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有许多独特的优点，主要体现在以下几个方面。①无毒无害，安全性高；②易被微生物降解，无二次污染；③使用范围广，脱色效果独特；④某些微生物絮凝剂的pH值稳定，热稳定性好，用量小；⑤来源广泛，生产周期短。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，产率高，絮凝效果好。

本发明还同时提供了一种生物絮凝剂在处理污水中的应用。

本发明所述的耐高温枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属，该菌株已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.3767。

本发明通过传统微生物学方法和现代分子生物学技术筛选平台，进行了微生物菌种的筛选、培养、鉴定等，最终得到代谢生物絮凝剂的耐高温枯草芽孢杆菌LEY₁₁。菌株LEY11为革兰氏阳性，兼性好氧菌，杆状，个体大小，长为2.5～3.5μm，宽为0.6μm，在细菌培养基上形成乳白色菌落，菌落为圆形；卵形，端生芽孢。

所述的利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，所述的耐高温枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3767；

制备方法步骤如下：

(1)菌种培养发酵：将耐高温枯草芽孢杆菌接入到液体培养基中在发酵罐中培养发酵36-108h得到发酵液；

(2)分离提纯：将发酵液离心后去除菌体，上清液超滤，浓缩至原体积的30-50％，预冷后加入等体积的甲醇或乙醇，4℃条件下静置3-8小时，过滤去除上清液，沉淀物用乙醚洗涤，然后真空干燥，得所述的生物絮凝剂。

步骤(1)中耐高温枯草芽孢杆菌的接种量为3-10％。

步骤(1)所述的培养发酵过程：发酵温度为40-50℃，pH为6.5-8.0，摇床转速为50-200rpm，通气量为2-8L/h。

步骤(1)所述的液体培养基包括碳源、氮源和无机盐。

优选的碳源选自葡萄糖、液体石蜡、可溶性淀粉、糊精、乳糖和酵母抽提物中的一种或几种。

优选的氮源选自氨基酸、黄豆饼粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵和尿素中的一种或几种。

优选的液体培养基由以下原料组成：

葡萄糖10-30g，K₂HPO₄ 5.0-5.7g，KH₂PO₄ 1-2g，(NH₄)₂SO₄ 0.5-1.0g，脲2.0-3.0g，NaCl0.1-0.2g，酵母膏0.5-2.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.0g，水1000mL。

步骤(2)所述的离心过程中转速是8000-10000r/min，离心时间10-20min。

所述的生物絮凝剂可用于污水处理。

与现有技术相比本发明的有益效果是：

本发明方法生产生物絮凝剂效益高、成本低、不污染环境；本发明的耐高温枯草芽孢杆菌LEY11最高生长温度85℃，最适生长温度45～65℃，由于发酵温度高，耐高温枯草芽孢杆菌产生的生物絮凝剂热稳定性高，发酵过程中污染少，容易控制，生物絮凝剂发酵温度最高达50℃，产量可达12g/L，絮凝率高达95％以上；本发明生物絮凝剂对有机污染降解效果十分明显，可大幅度提高污水的絮凝率，避免了使用化学絮凝剂对环境的污染，尤其适用于酒精发酵废水的处理。

本发明所述的耐高温枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属，该菌株已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），保藏编号为CGMCC No.3767。

附图说明

图1是实施例3所述的生物絮凝剂的红外谱图；

图2是实施例3所述的生物絮凝剂的核磁图；

图3是实施例3所述的生物絮凝剂的TLC分析图；

其中展层剂由氯仿，甲醇和水按照65：15：20的体积比组成，显色剂为茚三酮显色剂、肽类显红色。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

所述的利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，所述的耐高温枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3767；

制备方法步骤如下：

(1)菌种培养发酵：以3％的接种量将耐高温枯草芽孢杆菌接入到液体培养基中在发酵罐中培养发酵36h得到发酵液，其中发酵温度为40℃，pH为6.5，摇床转速为50rpm，通气量为2L/h；

液体培养基由以下原料组成：

葡萄糖10g，K₂HPO₄ 5.0g，KH₂PO₄ 1g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，脲2.0g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1000mL。

(2)分离提纯：将发酵液在转速8000r/min条件下离心10min后去除菌体，上清液超滤，浓缩至原体积的30％，预冷后加入等体积的甲醇或乙醇，4℃条件下静置3小时，过滤去除上清液，沉淀物用乙醚洗涤，然后真空干燥，得所述的生物絮凝剂。

所述的生物絮凝剂可用于污水处理。

实施例2

所述的利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，所述的耐高温枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3767；

制备方法步骤如下：

(1)菌种培养发酵：以10％的接种量将耐高温枯草芽孢杆菌接入到液体培养基中在发酵罐中培养发酵108h得到发酵液，其中发酵温度为50℃，pH为8.0，摇床转速为200rpm，通气量为8L/h；

液体培养基由以下原料组成：

葡萄糖30g，K₂HPO₄ 5.7g，KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，脲3.0g，NaCl0.2g，酵母膏2.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，水1000mL。

(2)分离提纯：将发酵液在转速10000r/min条件下离心20min后去除菌体，上清液超滤，浓缩至原体积的50％，预冷后加入等体积的甲醇或乙醇，4℃条件下静置8小时，过滤去除上清液，沉淀物用乙醚洗涤，然后真空干燥，得所述的生物絮凝剂。

所述的生物絮凝剂可用于污水处理。

实施例3

所述的利用耐高温枯草芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法，所述的耐高温枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.3767；

制备方法步骤如下：

(1)菌种培养发酵：以5％的接种量将耐高温枯草芽孢杆菌接入到液体培养基中在发酵罐中培养发酵80h得到发酵液，其中发酵温度为45℃，pH为7.0，摇床转速为100rpm，通气量为5L/h；

液体培养基由以下原料组成：

葡萄糖20g，K₂HPO₄ 5.4g，KH₂PO₄ 1.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.8g，脲2.8g，NaCl 0.15g，酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O 0.8g，水1000mL。

(2)分离提纯：将发酵液在转速9000r/min条件下离心15min后去除菌体，上清液超滤，浓缩至原体积的40％，预冷后加入等体积的甲醇或乙醇，4℃条件下静置5小时，过滤去除上清液，沉淀物用乙醚洗涤，然后真空干燥，得所述的生物絮凝剂。

所述的生物絮凝剂可用于污水处理。

实验：

将实施例3所述的生物絮凝剂分别进行红外(图1)、核磁(图2)和TLC分析(图3)，图1中3396.5cm^-1是由分子间氢键引起的N-H伸缩振荡，1650.8cm^-1与1537.4cm^-1为酰胺键吸收谱带，说明生物絮凝剂分子结构中有肽键；2961～2860cm^-1和1470～1380cm^-1的两处吸收是C-H伸缩振荡，说明絮凝剂是糖蛋白；图2核磁图：¹H NMR(CDCl₃)δ:3.95(3H,s,-OCH₃),4.01(3H,s,-OCH₃),6.49(1H,d,J＝22.5Hz,6-H),7.06(1H,s,3-H),7.19(1H,m,8-H),7.22(1H,m,Ar-H),7.40-7.45(7H,m,3’,4’,5’-H,Ar-H),7.94(2H,d,J＝21.5Hz,2’,6’-2H),9.05(1H,s,NH)；图3展层剂由氯仿，甲醇和水按照65：15：20的体积比组成，显色剂为茚三酮显色剂、肽类显红色。由图1-3可得出该生物絮凝剂主要成份为糖蛋白。

将实施例3所述的生物絮凝剂用于污水处理，以相同条件下的化学絮凝剂做对照，絮凝剂的加入量与污水的质量比为0.5-1.5％，静置30-60min后测定絮凝率表1；

表1

由表1可以看出对于普通污水，生物絮凝剂较化学絮凝剂絮凝率提高15％以上，对于含酒精发酵残渣的污水，生物絮凝剂较化学絮凝剂絮凝率提高20％以上，COD去除率增加了30％，说明本发明生物絮凝剂不但避免了使用化学絮凝剂对环境的污染，而且大幅度提高了污水的絮凝率，本发明尤其适用于酒精发酵废水的处理。