本发明属于生物
技术领域：
，涉及干细胞的诱导分化，具体涉及一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法。
背景技术：
：世界心脏联盟分析预计，2020年全球心血管疾病(CardiovascμLarDiseases，CVD)死亡率将增加50％，心肌梗死将成为人类的第一位死亡因素，严重威胁着人类的健康，同时给社会造成了巨大的经济负担。随着我国老龄化的加快，心血管疾病的发病率和死亡率逐年升高。目前对心血管疾病特别是心肌梗死及缺血性心肌病的治疗主要有药物、介入、外科冠脉搭桥和心脏移植治疗等方法。药物治疗可在一定程度上改善症状；经皮冠状动脉介入治疗术(PCI)可以开通闭塞血管，使心肌细胞血液供应改善，挽救濒临死亡的心肌细胞，急性心肌梗死后直接PCI术治疗能达到很好的临床效果；外科冠脉搭桥治疗通过移植的血管可改善闭塞血管远端心肌细胞的血液供应，显著改善心脏功能和临床症状。但是上述治疗方案均不能从根本上解决心肌缺血梗死后心肌细胞丧失的问题。心脏移植可从根本上改善症状和心脏功能，但是存在免疫排斥、费用昂贵、供体有限等问题，不能满足临床需求。近些年随着干细胞技术的深入发展，干细胞移植已成为一种新型治疗心血管疾病的方法，包括脂肪、骨髓、脐带血等组织来源的各类间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESCs)和骨骼肌成肌细胞、多能诱导干细胞(IPS)等，这些干细胞移植到心脏可以分化成心肌细胞或者通过分泌细胞因子修复受损心肌细胞起到治疗作用。但是这些心脏组织以外组织来源的干细胞在应用过程中存在很多不足之处，在体内、外研究中很难观察到功能完全的心肌细胞；同时多种干细胞所致恶性心律失常、致瘤、致畸性等问题还不甚明确。目前的研究显示，心脏干细胞具有自我更新、克隆形成、多向分化潜能，自体心脏干细胞移植可从根本上避免了免疫排斥反应、伦理问题、同时因其与心脏细胞有相同的遗传背景，致瘤和心律失常的发生率较低，将成为治疗心血管疾病理想的方案。大量的动物实验研究显示心脏干细胞移植到梗死的心脏可以分化生成新的心肌细胞，减少心脏梗死瘢痕面积、改善心脏重构、提高心脏功能。心脏干细胞因其独特的来源和性能将成为治疗心血管疾病理想的种子细胞。遗憾的是，心脏干细胞移植后定向分化为心肌细胞的分化率较低，这是心脏干细胞移植进一步发展必须克服的技术问题。技术实现要素：本发明的目的是提供一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，以提高心脏干细胞定向分化为心肌细胞的分化率，为心脏干细胞移植创造条件。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法，在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，诱导其定向分化为心肌细胞；所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQIDNO.1所示的外源性多肽。优选地，所述心脏干细胞诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，该培养基中还添加有谷氨酰胺、青霉素和链霉素。优选地，所述培养基中还添加1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素。当然，该培养基中含有所述定向分化诱导因子。优选地，所述定向分化诱导因子作用于心脏干细胞的浓度为6-14μmol/L。优选地，还可以在诱导培养液中添加序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或SEQIDNO.4的辅助因子，浓度为0.4-0.8μmol/L。这些辅助因子本身不具有诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的能力，但是可以强化上述定向分化诱导因子的诱导能力。优选地，所述心脏干细胞经过分离培养、纯化后再经定向分化诱导因子诱导分化。优选地，所述心脏干细胞的分离培养方法包括如下所述的步骤：步骤S1，切取部分右心耳组织，去除脂肪和血迹，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗3-5次，将组织块剪成组织碎块，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗至液体澄清；步骤S2，把组织碎块移入无菌离心管中，加入适量的0.1％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化1h；用无菌滴管轻轻吹打消化后的组织块，使细胞从疏松的组织块中脱落，然后置于冰块中静止10min，使未消化的组织块沉淀在离心管底部；移上清到无菌离心管中，1200rpm离心5min；弃去上清液，加入预先配好的新鲜心脏干细胞培养液重悬细胞，接种到T25培养瓶中，置于37℃含5％CO2的恒温孵箱中培养；所述心脏干细胞培养液为含10％胎牛血清的Ham'sF12培养液，其中含有0.2mmol/mLL-谷氨酰胺和10ng/mLHumanβ-FGF；步骤S3，第2d加入新的心脏干细胞培养液进行换液，以后每隔1d换液1次，等细胞融合到80％-90％进行传代；传代时，先用PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后加入心脏干细胞培养液用滴管反复吹打形成单细胞悬液，按1:2-1:3的比例接种到T25培养瓶中培养，以后4-5d传代一次。优选地，心脏干细胞的纯化方法包括如下所述的步骤：步骤S1，选2-4代传代细胞，等细胞融合到85％-95％时，弃去培养液，用无菌PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后用PBS重悬洗涤，1000rpm离心5min，反复3次，弃去上清液，加入PBS重悬细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数并调整细胞浓度为106个/mL，加入PE标记的CD117抗体4℃避光孵育30min；不加固定液固定，把PE标记的单细胞悬液上样于流式细胞仪，无菌分选出PE标记的c-kit+CSCs；步骤S2，无菌分选出的c-kit+CSCs收集到添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中，1000rpm离心5min，弃上清，加入添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中重悬细胞，接种到6孔板或者T25细胞培养瓶中培养；步骤S3，第2d完全换液，以后隔2d换液一次，换液2次后改换不含青霉素和链霉素的心脏干细胞培养液培养；细胞融合到80％-90％进行传代，方法同上所述。优选地，定向分化诱导因子诱导心脏干细胞分化的方法包括如下所述的步骤：步骤S1，选无菌分选纯化细胞融合85％-95％的c-kit+CSCs，更换成诱导培养液，该诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加有6-14μmol/L定向分化诱导因子、1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素；24h后弃去诱导培养液，PBS洗涤2次，更换成不含定向分化诱导因子的诱导培养液继续培养，以后每3d换液1次；步骤S2，诱导结束后，每隔2d更换不含定向分化诱导因子的诱导培养液1次，在含5％CO2的37℃恒温孵箱中培养4W。本发明的有益效果：本发明提供的方法通过在心脏干细胞诱导培养液中添加如SEQIDNO.1所示的定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，可以有效诱导其定向分化为心肌细胞。实验结果显示分化的细胞表达肌钙蛋白T/肌钙蛋白I、β-肌球蛋白重链(β-MHC)等心肌细胞特异性蛋白。附图说明图1：Westernblotting法测定cTnI、Cx43表达的定性结果；图2：Westernblotting法测定cTnI表达的定量结果；图3：Westernblotting法测定Cx43表达的定量结果。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明的技术方案。未详细说明的实验方法均为本领域常规方法，未详细介绍的实验材料均为本领域技术人员可以获得的市售常规材料。实施例1：定向分化诱导因子和辅助因子的制备定向分化诱导因子和辅助因子均为多肽，多肽的合成方法已经非常成熟，可以在实验室自己采用固相法合成，也可以直接委托给生物外包公司合成。本发明中的涉及的多肽均由本公司研发人员通过Fmoc法固相合成制备。Fmoc法固相合成技术：合成反应按照从C端向N端进行，Rink介质上有自由氨基；每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10分钟；每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟；最后，所有氨基酸残基顺序连接后，用98％三氟乙酸从Rink介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。本发明定向分化诱导因子(SEQIDNO.1所示)、辅助因子A(SEQIDNO.2所示)、辅助因子B(SEQIDNO.3所示)、辅助因子C(SEQIDNO.4所示)均经质谱鉴定无误。实施例2：心脏干细胞体外分离培养包括如下步骤：步骤S1，切取部分右心耳组织，去除脂肪和血迹，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗3-5次，将组织块剪成组织碎块，用预冷的D-PBS缓冲液冲洗至液体澄清；步骤S2，把组织碎块移入无菌离心管中，加入适量的0.1％Ⅱ型胶原酶，37℃水浴锅中震荡消化1h；用无菌滴管轻轻吹打消化后的组织块，使细胞从疏松的组织块中脱落，然后置于冰块中静止10min，使未消化的组织块沉淀在离心管底部；移上清到无菌离心管中，1200rpm离心5min；弃去上清液，加入预先配好的新鲜心脏干细胞培养液重悬细胞，接种到T25培养瓶中，置于37℃含5％CO2的恒温孵箱中培养；所述心脏干细胞培养液为含10％胎牛血清的Ham'sF12培养液，其中含有0.2mmol/mLL-谷氨酰胺和10ng/mLHumanβ-FGF；步骤S3，第2d加入新的心脏干细胞培养液进行换液，以后每隔1d换液1次，等细胞融合到80％-90％进行传代；传代时，先用PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后加入心脏干细胞培养液用滴管反复吹打形成单细胞悬液，按1:2-1:3的比例接种到T25培养瓶中培养，以后4-5d传代一次。选2-4代细胞进行细胞表面标志物流式细胞学检测，包括如下步骤：步骤S1，弃去培养液，用无菌PBS洗涤3次，室温下加入0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA1mL消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液；步骤S2，把细胞悬液移入15mL无菌离心管中，常温，1000rpm离心5min；弃去上清液，用PBS重悬洗涤，1000rpm离心5min，反复3次；弃去上清液，加入PBS重悬细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数并调整细胞浓度为106个/mL；步骤S3，分别加入10μLPE标记的抗人CD117单克隆抗体、FITC标记抗人CD31单克隆抗体、PE/Cy5标记抗人CD45单克隆抗体，同型对照加入PE、FITC标记的抗小鼠IgG抗体，充分混匀，4℃避光孵育30min；1000rpm离心5min，弃去上清液，加入PBS重悬洗涤，1000rpm离心5min，反复3次，弃去上清液，每组加入300μL的PBS吹打混匀，制成单细胞悬液，此步骤在避光条件下进行；步骤S4，加适量固定液固定后把各样本上样于流式细胞仪，测定PE、FITC、PE/Cy5标记的细胞各占细胞总数的百分比。实验结果：1、原代细胞生物学特点组织块经过0.1％Ⅱ型胶原酶消化离心后获得的单细胞悬液接种到T25培养瓶中培养，倒置相差显微镜下观察，细胞10d左右贴壁，贴壁细胞大小不一，呈三角形、梭形、多角形，折光性强，贴壁后1W左右细胞快速增殖，向四周呈集落样生长，20d左右可融合达80％。2、细胞表面标志物检测结果经过流式细胞仪检测提示分离培养的细胞中含有c-kit+(CD117+)标志的CSCs，含有CD31标志的血管内皮祖细胞，不含CD45标志的血系干细胞。流式细胞仪检测统计结果显示：CD117阳性表达率平均为(35.5±6.2)％，CD31阳性表达率平均为(6.8±2.7)％、CD45阳性表达率平均为(1.6±0.4)％。上述方法可以短期内获得纯度较高的c-kit+CSCs。实施例3：心脏干细胞的纯化及鉴定纯化包括如下步骤：步骤S1，选3代传代细胞，等融合到90％时，弃去培养液，无菌PBS洗涤3次，室温下加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化，在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液，把细胞悬液移入无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃上清后用PBS重悬洗涤，1000rpm离心5min，反复3次，弃去上清液，加入PBS重悬细胞制成单细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数并调整细胞浓度为106个/mL，加入PE标记的CD117抗体4℃避光孵育30min；不加固定液固定，把PE标记的单细胞悬液上样于流式细胞仪，无菌分选出PE标记的c-kit+CSCs；步骤S2，无菌分选出的c-kit+CSCs收集到添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中，1000rpm离心5min，弃上清，加入添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中重悬细胞，接种到6孔板或者T25细胞培养瓶中培养；步骤S3，第2d完全换液，以后隔2d换液一次，换液2次后改换不含青霉素和链霉素的心脏干细胞培养液培养；细胞融合到80％-90％进行传代，方法同实施例2。免疫荧光染色测定：步骤S1，细胞爬片：选融合到80％-90％无菌分选后的c-kit+CSCs，弃去培养液，加入PBS洗涤2次，然后加入1mL0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA消化。倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后，加入心脏干细胞培养液终止消化，用无菌弯头滴管吹打细胞培养瓶底部使细胞脱落形成细胞悬液，移入到15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液之后用心脏干细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×105/mL，把1mLc-kit+CSCs单细胞悬液加入到预先放置于24孔板之中的无菌玻璃爬片上。轻移静置于含5％CO2的37℃恒温孵箱中培养。倒置显微镜下观察细胞长满爬片的70％-80％时进行免疫荧光染色；步骤S2，将制备好的细胞爬片用PBS轻摇洗涤3次，每次3min；步骤S3，将细胞爬片置于玻璃皿中，加入4℃预冷的冰丙酮淹没细胞爬片，4℃固定20min；步骤S4，弃去固定液，加入PBS，摇洗3次，每次5min，风干；步骤S5，用中性树胶将细胞爬片固定于载玻片上；步骤S6，加入50μL1:10PEanti-humanCD117，37℃避光孵育1h；步骤S7，用PBS摇洗3次，每次5min，风干；步骤S8，加入2μg/mL的DAPI室温孵育3min，PBS摇洗3次，每次5min，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。实验结果：1、心脏干细胞生长特征：经流式细胞仪无菌分选收集到的c-kit+CSCs，接种到6孔板或T25培养瓶中，细胞培养24h后倒置显微镜下观察，细胞均匀贴壁生长，与原代细胞比较细胞体积较小，细胞形态相似，呈长梭形或短梭形，折光性强，经7d左右停滞期后细胞快速向四周快速扩增，14d左右可融合达80％。2、采用流式细胞仪无菌分选PEanti-humanCD117抗体标记2-8代的细胞，c-kit+CSCs的纯度可提高到99.3％。实施例4：定向分化诱导因子对心脏干细胞的诱导分化作用包括如下步骤：步骤S1，选无菌分选纯化细胞融合85％-95％的c-kit+CSCs，更换成诱导培养液，该诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加有10μmol/L定向分化诱导因子、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；24h后弃去诱导培养液，PBS洗涤2次，更换成不含定向分化诱导因子的诱导培养液继续培养，以后每3d换液1次；步骤S2，诱导结束后，每隔2d更换不含定向分化诱导因子的诱导培养液1次，在含5％CO2的37℃恒温孵箱中培养4W。同时设置对照组，对照组除不添加定向分化诱导因子外，其他与上述实验组相同。定向分化诱导因子作用于心脏干细胞的浓度在6-14μmol/L均可，培养基中谷氨酰胺浓度可在1-3mmol/L调整，青霉素浓度可在80-120U/mL调整，链霉素浓度可在80-120μg/mL调整。心脏干细胞向心肌细胞诱导分化的测定：1、诱导分化后心肌细胞特异蛋白cTnI、Cx43WesternBlot测定收集诱导4周后各组细胞加入裂解液提取细胞总蛋白，12000rpm，4℃离心20min。上清液1:4加入5×蛋白上样缓冲液混匀，100℃沸水煮10min，冷却后-20℃保存备用。配胶、上样、电泳，溴酚蓝指示条带距离玻璃板下端1.0cm时关闭电源开关停止电泳并转膜。立春红染色后5％脱脂奶粉封闭。分别孵一抗(Cx431:5000、cTnI1:2000、抗β-tublin1:4000)，摇床4℃过夜。孵二抗：HRP标记的山羊抗兔、小鼠IgG二抗(1:2000)，室温摇床慢摇孵育1h。加入显影剂，放于凝胶成像系统中曝光成像。2、诱导分化后心肌细胞分化率流式细胞学测定0.05％胰酶-0.02mmol/LEDTA1ml消化收集诱导4周的细胞。PBS洗涤调整细胞悬液密度约1×106个细胞/ml，加入0.1％TritonX-100室温孵育，PBS洗涤重悬滴加cTnI抗体，37℃孵育1h，再加FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37℃避光孵育30min，4％多聚甲醛固定20min。最后流式细胞仪测定各组FITC标记阳性细胞的比例。实验结果：1、诱导分化后细胞cTnI、Cx43的表达诱导4周后用Westernblotting法测定各组细胞心肌特异性蛋白cTnI、Cx43的表达。结果显示：实验组(添加定向分化诱导因子)和对照组(不添加定向分化诱导因子)细胞均有cTnI、Cx43表达，对照组表达较弱，实验组表达较强，差异显著(P＜0.01)。如图1-3。2、诱导分化后心肌细胞分化率分析采用流式细胞仪测定细胞FITC标记cTnI的表达，测定诱导4周后各组细胞心肌细胞分化率，分化率分别为：对照组36.5％，实验组72.4％。结果表明，SEQIDNO.1所示定向分化诱导因子可诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞。实施例5：辅助因子对定向分化诱导因子诱导能力的强化作用实验中还发现，SEQIDNO.2所示的辅助因子A、SEQIDNO.3所示的辅助因子B和SEQIDNO.4所示的辅助因子C可以强化定向分化诱导因子诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的能力，但辅助因子A、B、C本身并不能诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞。实验结果如下：作用浓度心肌细胞分化率对照组36.5％辅助因子A0.6μmol/L36.3％辅助因子B0.6μmol/L37.2％辅助因子C0.6μmol/L36.7％定向分化诱导因子10μmol/L72.4％定向分化诱导因子6μmol/L+辅助因子A0.6μmol/L84.3％定向分化诱导因子6μmol/L+辅助因子B0.6μmol/L79.8％定向分化诱导因子6μmol/L+辅助因子C0.6μmol/L85.9％上述实施例表明，本发明提供的方法通过在心脏干细胞诱导培养液中添加如SEQIDNO.1所示的定向分化诱导因子，使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞，可以有效诱导其定向分化为心肌细胞。实验结果显示分化的细胞表达肌钙蛋白T/肌钙蛋白I、β-肌球蛋白重链(β-MHC)等心肌细胞特异性蛋白。序列如SEQIDNO.2-4的辅助因子A、B、C对定向分化诱导因子的诱导能力具有明显的强化作用。上述实施例的作用仅在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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