一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法与流程

文档序号:11125963阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于:在心脏干细胞诱导培养液中添加定向分化诱导因子,使定向分化诱导因子作用于培养的心脏干细胞,诱导其定向分化为心肌细胞;所述定向分化诱导因子为一种序列如SEQ ID NO.1所示的外源性多肽。

2.根据权利要求1所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于:所述心脏干细胞诱导培养液为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,该培养基中还添加有谷氨酰胺、青霉素和链霉素。

3.根据权利要求2所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于:所述培养基中还添加1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素。

4.根据权利要求1所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于:所述定向分化诱导因子作用于心脏干细胞的浓度为6-14μmol/L。

5.根据权利要求1-4任一所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于:所述心脏干细胞经过分离培养、纯化后再经定向分化诱导因子诱导分化。

6.根据权利要求5所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于,所述心脏干细胞的分离培养方法包括如下所述的步骤:

步骤S1,切取部分右心耳组织,去除脂肪和血迹,用预冷的D-PBS缓冲液冲洗3-5次,将组织块剪成组织碎块,用预冷的D-PBS缓冲液冲洗至液体澄清;

步骤S2,把组织碎块移入无菌离心管中,加入适量的0.1%Ⅱ型胶原酶,37℃水浴锅中震荡消化1h;用无菌滴管轻轻吹打消化后的组织块,使细胞从疏松的组织块中脱落,然后置于冰块中静止10min,使未消化的组织块沉淀在离心管底部;移上清到无菌离心管中,1200rpm离心5min;弃去上清液,加入预先配好的新鲜心脏干细胞培养液重悬细胞,接种到T25培养瓶中,置于37℃含5%CO2的恒温孵箱中培养;所述心脏干细胞培养液为含10%胎牛血清的Ham's F12培养液,其中含有0.2mmol/mL L-谷氨酰胺和10ng/mL Human β-FGF;

步骤S3,第2d加入新的心脏干细胞培养液进行换液,以后每隔1d换液1次,等细胞融合到80%-90%进行传代;传代时,先用PBS洗涤3次,室温下加入1mL 0.05%胰酶-0.02mmol/L EDTA消化,在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后,加入心脏干细胞培养液终止消化,用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液,把细胞悬液移入无菌离心管中,1000rpm离心5min,弃上清后加入心脏干细胞培养液用滴管反复吹打形成单细胞悬液,按1:2-1:3的比例接种到T25培养瓶中培养,以后4-5d传代一次。

7.根据权利要求6所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于,心脏干细胞的纯化方法包括如下所述的步骤:

步骤S1,选2-4代传代细胞,等细胞融合到85%-95%时,弃去培养液,用无菌PBS洗涤3次,室温下加入1mL 0.05%胰酶-0.02mmol/L EDTA消化,在倒置显微镜下观察贴壁细胞回缩变圆后,加入心脏干细胞培养液终止消化,用无菌滴管反复吹打瓶底使细胞从瓶底脱落形成细胞悬液,把细胞悬液移入无菌离心管中,1000rpm离心5min,弃上清后用PBS重悬洗涤,1000rpm离心5min,反复3次,弃去上清液,加入PBS重悬细胞制成单细胞悬液,用细胞计数板进行细胞计数并调整细胞浓度为106个/mL,加入PE标记的CD117抗体4℃避光孵育30min;不加固定液固定,把PE标记的单细胞悬液上样于流式细胞仪,无菌分选出PE标记的c-kit+CSCs;

步骤S2,无菌分选出的c-kit+CSCs收集到添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中,1000rpm离心5min,弃上清,加入添加1000U/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的心脏干细胞培养液中重悬细胞,接种到6孔板或者T25细胞培养瓶中培养;

步骤S3,第2d完全换液,以后隔2d换液一次,换液2次后改换不含青霉素和链霉素的心脏干细胞培养液培养;细胞融合到80%-90%进行传代,方法同权利要求6中步骤S3所述。

8.根据权利要求7所述的诱导心脏干细胞定向分化为心肌细胞的方法,其特征在于,定向分化诱导因子诱导心脏干细胞分化的方法包括如下所述的步骤:

步骤S1,选无菌分选纯化细胞融合85%-95%的c-kit+CSCs,更换成诱导培养液,该诱导培养液为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,添加有6-14μmol/L定向分化诱导因子、1-3mmol/L谷氨酰胺、80-120U/mL青霉素和80-120μg/mL链霉素;24h后弃去诱导培养液,PBS洗涤2次,更换成不含定向分化诱导因子的诱导培养液继续培养,以后每3d换液1次;

步骤S2,诱导结束后,每隔2d更换不含定向分化诱导因子的诱导培养液1次,在含5%CO2的37℃恒温孵箱中培养4周。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1