基于金‑上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法与流程

文档序号:12109138阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于, 包括制备检测探针所用核酸的设计,金-上转换纳米粒子四面体检测探针的制备,四面体的功能化,胞内microRNA-21检测方法的建立;步骤为:

(1)所用DNA序列设计;

(2)金-上转换纳米粒子四面体检测探针的制备;

(3)四面体的功能化;

(4)胞内microRNA-21检测方法的建立;

(5)不同细胞中microRNA-21的检测。

2.根据权利要求1所述基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于所用DNA序列设计:

DNA-Py1:5’-SH-TTTTCAACAT CAGTCTGATA AGCTACTGTT CTTTCCCTCA ACATCAGTCT GATAAGCTAC GGTTTTCAAC ATCAGTCTGA TAAGCTACTT GAC-3’,下划线标注的碱基用硫代磷酸修饰;

DNA-Py2:5’- SH-TTTCCGTAGC TTATCAGTTA AGCTAGGGTT TCATTAATCA ACATCAGTTC GATAAGCTAT TTTCAACATC AGTCTGATAA GCTACAACTT-3’,下划线标注的碱基用硫代磷酸修饰;

DNA-Py3:5’- SH-TTTACTAAGC GATTACTGAT GTTGATTAAT GTTTACAACA TCAGTCTGAT AAGCTAACTG ATTTTGAACA GTAGCTTATC AGGACTCGTG GTC-3’,下划线标注的碱基用硫代磷酸修饰;

DNA-Py4:5’- SH-TTTAAGTTGT AGCTTATCAG CTGACTACAT TTTTGTCAAG TAGCTTATCA GTTACAGCTC GCTTTATCAG TTAGCTTATC AGAGATCGTA GCT-3’,下划线标注的碱基用硫代磷酸修饰;

miR-21:5’-UAGCUUAUCA GACUGAUGUU GA-3’,

control1:5’- AAGCUUAUCU GACUGAUGUU GU-3’,

control2:5’- UACCUUAUCA GACUGAUGCU GA-3’,

miR-200b:5’- UAAUACUGCC UGGUAAUGAU GA-3’,

let-7d:5’- AGAGGUAGUA GGUUGCAUAG UU-3’。

3.根据权利要求1所述基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于金-上转换纳米粒子四面体检测探针的制备:

(1)首先制备金纳米粒子和核酸的偶联物:把20nM的金纳米粒子AuNP分别和DNA-Py3,DNA-Py4按摩尔比1︰3.5比例混合在一起,反应1h后加入NaCl溶液至终浓度为50mM,混合均匀,反应过夜,离心去除游离的核酸,即得到AuNP-DNA-Py 3,AuNP-DNA-Py 4;

(2)然后制备上转换纳米粒子和核酸的偶联物:把20nM的上转换纳米粒子UCNP分别和DNA-Py1,DNA-Py2按摩尔比1︰3.5比例混合在一起,反应1h后加入NaNO3溶液至终浓度为50mM,混合均匀,反应过夜,离心去除游离的核酸,即得到UCNP-DNA-Py 1,UCNP-DNA-Py 2;

(3)把步骤(1)、(2)得到的AuNP-DNA-Py3和AuNP-DNA-Py4,UCNP-DNA-Py1和UCNP-DNA-Py 2分别混合,加入NaCl至终浓度为50mM,95℃水浴5min,然后37℃孵育8h,即得到金二聚体及上转换二聚体;把金二聚体和上转换二聚体按照摩尔比1︰1的比例混合,37℃孵育24h,即制备得到检测microRNA-21用的金-上转换纳米粒子四面体检测探针溶液。

4.根据权利要求1所述基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于四面体的功能化:将巯基修饰的PEG-5000溶液按照PEG︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到四面体检测探针溶液中,15min后离心除去多余的PEG分子,然后把穿膜肽分子TAT按照TAT︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到PEG修饰过的四面体溶液中,室温反应24h,离心除去多余的未连在四面体上的穿膜肽。

5.根据权利要求1所述基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于, 胞内microRNA-21检测方法的建立:

首先用商业转染试剂lipofectamine RNAiMAX transfection reagent和不同量的microRNA-21来增加细胞中microRNA-21的量,或者用microRNA-21的反义序列来降低细胞中的microRNA-21的量,然后用RT-PCR来确定转染后细胞中的microRNA-21的量;具体方法如下:

(1)首先建立人工合成的有梯度的microRNA-21的扩增曲线,然后建立循环数和microRNA-21的浓度之间的线性关系;

(2)然后提取转染后的细胞中的总RAN,用RT-PCR扩增得到microRNA-21的扩增曲线,根据扩增曲线得到循环数,根据循环数从标准曲线中确定含有的microRNA-21,用含有四面体的培养基1640+10%FBS+双抗来培养转染后的细胞,8h后洗去细胞外面的四面体,测定细胞内的CD信号及上转换荧光强度,分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度之间的标准曲线。

6.根据权利要求1所述基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法,其特征在于,不同细胞中microRNA-21的检测:

用含有四面体的培养基1640+10%FBS+双抗分别培养MCF-7,HeLa,PCS-460-010细胞,8h后,检测细胞中的CD信号及上转换荧光强度,然后根据分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线来确定细胞中microRNA-21的含量。

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