基于金‑上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法与流程

基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的方法，属于材料化学生物领域。

背景技术：

MicroRNA（miRNA）是一类小分子的非编码调控基因（19~22 碱基），广泛地存在于植物、动物及病毒基因之中。miRNA 在细胞分化、增殖、凋亡及癌变等生物过程中都扮演着重要的角色，miRNA 的表达水平与人类的重大疾病，尤其癌症，密切相关。传统的miRNA检测方法局限于胞内miRNA成像以及基于荧光信号的定量检测。但是荧光信号的光不稳定性、短的量子寿命、易光漂白等特性大大限制了基于荧光信号的胞内原位检测方法的应用。

由纳米粒子可控自组装的纳米结构有规则的几何形状，稳定的结构，很强的光学活性。基于这些性质，自组装的纳米结构已经被广泛的应用于生物传感。但是基于纳米组装结构的胞内microRNA的检测还没有报导。近年来，手性等离子光学活性已经成为一个热点话题引起了广泛的关注。发展了很多基于手性纳米组装体的超灵敏的传感检测方法来检测核酸片段和血液中的癌症标志物。但是，在生物领域活的癌细胞中的应用仍然有待探索。

近年来，手性自组装纳米材料获得了广泛的关注。本发明建立了一种基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的检测方法，是一种超灵敏，高特异性的胞内microRNA的原位检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于手性金-上转换纳米粒子四面体的双模态信号的胞内microRNA的超灵敏检测方法。

本发明的技术方案，基于金-上转换纳米粒子四面体的发光信号和手性信号原位检测细胞中microRNA的方法，包括制备检测探针所用核酸的设计，金-上转换纳米粒子四面体检测探针的制备，四面体的功能化，胞内microRNA检测方法的建立；具体步骤为:

（一）检测方法的建立

（1）20nm金纳米粒子的制备

洁净的三口烧瓶中加入 97.5mL 超纯水，加入2.5mL 0.4% 氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min 后加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15min，自然冷却后放置在4℃冰箱备用。

（2）19nm上转换纳米粒子(NaGdF₄:Yb,Er)的制备

在含有14mL OA（配体十八烯酸）和16mL ODE（非配位有机溶剂十八烯）的混合液中加入0.80mmol的GdCl₃∙ 6H₂O，0.18mmol 的YbCl₃ ∙6H₂O 和0.02mmol的ErCl₃ ∙ 6H₂O，溶解。在氮气的保护下加热到150℃形成均相的溶液。降至室温后，含有0.100g的 NaOH和0.148g的NH₄F的10 mL甲醇溶液慢慢加入。反应混合液在50℃下慢慢搅拌30min，然后在100℃在真空下处理10min除去甲醇，在氮气的保护下加热到320℃，并且保持1h。将混合物降至室温，反应结束。乙醇中沉淀的合成的NaGdF₄粒子用离心收集，并用乙醇洗涤几次，最后重悬在THF或者环己烷溶液中供后续实验使用。上转换纳米粒子的转相：100mg用马来酰亚胺基团和磷酸基团修饰的PEG和10mg 油酸包裹的NaGdF₄粒子混合在THF溶液里面，在室温下搅拌过夜。PEG包裹的NaGdF₄粒子在环己烷中沉淀，并用环己烷洗涤三次，在室温真空的条件下干燥，得到了可以在水中溶解的PEG包裹的NaGdF₄粒子。

（3）检测用的核酸探针的设计与合成

表1. microRNA检测用DNA序列设计

注：本发明所使用的 DNA 均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

（4）金-上转换纳米粒子四面体检测探针的制备

首先制备金纳米粒子和核酸的偶联物：把20nM金纳米粒子（AuNP）分别和DNA-Py3，DNA-Py4按摩尔比1︰3.5的比例混合在一起，反应1h后加入NaCl溶液至终溶度为50mM，混合均匀，反应过夜，离心去除游离的核酸，即得到AuNP-DNA-Py 3，AuNP-DNA-Py 4。然后制备上转换纳米粒子和核酸的偶联物：把20nM上转换纳米粒子（UCNP）分别和DNA-Py1，DNA-Py2按摩尔比1︰3.5比例混合在一起，反应1h后加入NaNO₃溶液至终溶度为50mM，混合均匀，反应过夜，离心去除游离的核酸，即得到UCNP-DNA-Py1，UCNP-DNA-Py 2。接下来把得到的AuNP-DNA-Py3和AuNP-DNA-Py4，UCNP-DNA-Py1和UCNP-DNA-Py 2分别混合，加入NaCl至终浓度为50mM，95℃水浴5min，然后37℃孵育8h，即得到金二聚体及上转换二聚体。把金二聚体和上转换二聚体按照摩尔比1︰1的比例混合，37℃孵育24h，即制备得到检测microRNA-21用的金-上转换纳米粒子四面体检测探针溶液。

（5）四面体的功能化

将巯基修饰的PEG（分子量：5000）溶液按照PEG︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到四面体检测探针溶液中，15min后离心除去多余的PEG分子。然后把穿膜肽分子（TAT）按照TAT︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到PEG修饰过的四面体溶液中，室温反应24h，离心除去多余的未连在四面体上的穿膜肽。

（6）活细胞内microRNA-21检测方法的建立

首先用商业转染试剂(lipofectamine RNAiMAX transfection reagent)和不同量的microRNA-21来增加细胞中microRNA-21的量，或者用microRNA-21的反义序列来降低细胞中的microRNA-21的量，然后用RT-PCR来确定转染后细胞中的microRNA-21的量。具体方法如下：首先建立人工合成的有梯度的microRNA-21的扩增曲线，然后建立循环数和microRNA-21的浓度之间的线性关系。然后提取转染后的细胞中的总RAN，然后用RT-PCR扩增得到里面含有microRNA-21的扩增曲线，根据扩增曲线得到循环数，然后根据循环数从标准曲线中确定含有的microRNA-21，然后用含有四面体的培养基(1640+10%FBS+双抗)来培养转染后的细胞，8h后洗去细胞外面的四面体，测定细胞内的CD信号及上转换荧光强度，然后分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度之间的标准曲线。

（7）不同细胞中microRNA-21的检测

用含有四面体的培养基（1640+10%FBS+双抗）分别培养MCF-7，HeLa, PCS-460-010细胞，8h后，检测细胞中的CD信号及上转换荧光强度，然后根据分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度之间的标准曲线来确定细胞中microRNA-21的含量。

本发明的有益效果：本发明将DNA驱使的金-上转换纳米粒子组装的四面体用于胞内miRNA的实时检测。金-上转换纳米粒子四面体具有双重的光学活性，在521nm呈现了很强的等离子圆二色谱信号，并在500-600nm有显著的上转换荧光强度，因此可以利用这双重信号来检测细胞中的miRNA。在目标miRNA的存在下，CD信号会减弱，荧光强度会增强。实验结果显示，CD信号与目标miRNA浓度在0.073 到 43.65 fmol/10µg RNA范围内有很好的线性关系，检测限可以达到0.03 fmol/10µg RNA，而上转换荧光强度与目标miRNA浓度的线性范围是0.16 - 43.65 fmol/10µg RNA，最低检测限是0.12 fmol/10µg RNA。这些结果说明了CD信号对miRNA的浓度变化比荧光强度有更高的灵敏度。强的CD信号来自于光子自旋角动量的相互作用以及四面体中DNA分子对手性的增强作用。

本发明不仅建立了胞内miRNA的超灵敏定量检测方法，同时也为组装体等离子手性的生物应用开辟了道路。本发明建立了一种基于金-上转换纳米粒子四面体的双信号原位检测胞内microRNA的检测方法，是一种超灵敏，高特异性的胞内microRNA的原位检测方法。

附图说明

图1(A)金-上转换纳米粒子四面体检测细胞中microRNA的示意图；(B)四面体的核酸骨架，1和2的位点与上转换纳米粒子联接，3和4的位点与金纳米粒子联接。

图2组装的四面体的透射电镜图。

图3组装的四面体的产率统计图。

图4细胞外检测能力的评价：(A) 添加一系列不同浓度得到的手性信号图； (B)添加一系列不同浓度得到的荧光信号图。

图5检测特异性的评价：(C) 添加不同种类的microRNA得到的手性信号图；(D)添加不同种类的microRNA得到的荧光信号图。

图6细胞内microRNA检测的CD信号图。

图7细胞内microRNA检测的上转换发光图。

图8 CD信号的强度与细胞内microRNA的量之间的标准曲线。

图9上转换荧光强度与细胞内microRNA的量之间的标准曲线。

图10用所建立的细胞内检测microRNA的方法检测不同细胞中的microRNA的CD信号图。

图11用所建立的细胞内检测microRNA的方法检测不同细胞中的microRNA的上转换发光图。

具体实施方式

实施例1 金纳米粒子和上转换纳米粒子(NaGdF₄:Yb,Er)的制备

（1）20nm金纳米粒子的制备

洁净的三口烧瓶中加入 97.5mL 超纯水，加入2.5mL 0.4% 氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min 后加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15min。自然冷却后放置在4℃冰箱备用。

（2）19nm上转换纳米粒子(NaGdF₄:Yb,Er)的制备

在含有14mL OA（配体十八烯酸）和16mL ODE（非配位有机溶剂十八烯）的混合液中加入0.80mmol的GdCl₃∙ 6H₂O，0.18mmol 的YbCl₃ ∙6H₂O 和0.02mmol的ErCl₃ ∙ 6H₂O，溶解。在氮气的保护下加热到150℃形成均相的溶液。降至室温后，含有0.100 g的 NaOH和0.148 g的NH₄F的10 mL甲醇溶液慢慢加入。反应混合液在50℃下慢慢搅拌30min，然后在100℃在真空下处理10min除去甲醇，在氮气的保护下加热到320℃，并且保持1h。将混合物降至室温，反应结束。乙醇中沉淀的合成的NaGdF₄粒子用离心收集，并用乙醇洗涤几次，最后重悬在THF或者环己烷溶液中供后续实验使用。上转换纳米粒子的转相：100mg用马来先亚胺基团和磷酸基团修饰的PEG和10mg 油酸包裹的NaGdF₄粒子混合在THF溶液里面，在室温下搅拌过夜。PEG包裹的NaGdF₄粒子在环己烷中沉淀，并用环己烷洗涤三次，在室温真空的条件下干燥，得到了可以在水中溶解的PEG包裹的NaGdF₄粒子。

实施例2

microRNA检测用DNA序列设计

注：本发明所使用的 DNA 均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

实施例3 检测探针的制备

首先制备金纳米粒子和核酸的偶联物：把20nM的金纳米粒子（AuNP）分别和DNA1-Py3，DNA-Py4按摩尔比1︰3.5的比例混合在一起，反应1h后加入NaCl溶液至终溶度为50mM，混合均匀，反应过夜，离心去除游离的核酸，即得到AuNP-DNA-Py3，AuNP-DNA-Py4。然后制备上转换纳米粒子和核酸的偶联物：把20nM上转换纳米粒子（UCNP）分别和DNA-Py1，DNA-Py2按摩尔比1︰3.5的比例混合在一起，反应1h后加入NaNO₃溶液至终溶度为50mM，混合均匀，反应过夜，离心去除游离的核酸，即得到UCNP-DNA-Py1，UCNP-DNA-Py2。接下来把得到的AuNP-DNA-Py3和AuNP-DNA-Py4，UCNP-DNA-Py1和UCNP-DNA-Py2分别混合，加入NaCl至终浓度为50mM，95℃水浴5min，然后37℃孵育8h，即得到金二聚体及上转换二聚体。把金二聚体和上转换二聚体按照摩尔比1︰1的比例混合，37℃孵育24h，即制备得到检测microRNA-21用的金-上转换纳米粒子四面体检测探针溶液。

实施例4 四面体的功能化

将巯基修饰的PEG（分子量：5000）溶液按照PEG︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到四面体检测探针溶液中，15min后离心除去多余的PEG分子。然后把穿膜肽分子（TAT）按照TAT︰四面体摩尔比1000︰1的比例加入到PEG修饰过的四面体溶液中，室温反应24h，离心除去多余的未连在四面体上的穿膜肽。

实施例5 活细胞内microRNA-21检测方法的建立

首先用商业转染试剂(lipofectamine RNAiMAX transfection reagent)和不同量的microRNA-21来增加细胞中microRNA-21的量，或者用microRNA-21的反义序列来降低细胞中的microRNA-21的量，然后用RT-PCR来确定转染后细胞中的microRNA-21的量。具体方法如下：首先建立人工合成的有梯度的microRNA-21的扩增曲线，然后建立循环数和microRNA-21的浓度之间的线性关系。然后提取转染后的细胞中的总RAN,然后用RT-PCR扩增得到里面含有microRNA-21的扩增曲线，根据扩增曲线得到循环数，然后根据循环数从标准曲线中确定含有的microRNA-21的量（浓度），然后用含有四面体的培养基(1640+10%FBS+双抗)来培养转染后的细胞（如MCF-7），8h后洗去细胞外面的四面体，测定细胞内的CD信号和上转换荧光强度。然后分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度之间的标准曲线。

实施例6 不同细胞中microRNA-21的检测

用含有四面体的培养基(1640+10%FBS+双抗)分别培养MCF-7，HeLa，PCS-460-010细胞，8h后检测细胞中的CD信号及上转换荧光强度，然后根据分别建立CD信号和细胞内microRNA-21的浓度的标准曲线以及上转换荧光强度与细胞内microRNA-21的浓度之间的标准曲线来确定细胞中microRNA-21的含量。