ZNF800基因在制备骨质疏松症早期筛查产品中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物领域，具体涉及ZNF800基因在制备骨质疏松症早期筛查产品中的应用。

背景技术：

骨质疏松症(osteoporosis)是一种以骨量降低、骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。骨质疏松症发病缓慢，以骨骼疼痛和脆性骨折为特征。随着社会发展和人口老龄化，骨质疏松症已经成为最为常见的疾病之一。目前骨质疏松症已经成为多发病和常见病，随着年龄增长而发病率增加。我国是世界人口和老年人口最多的国家，同时也是骨质疏松症和潜在骨质疏松症患者最多的国家。我国60岁以上骨质疏松症患者大约为2900万例，低骨量患者为1700万例。我国60岁以上骨质疏松骨折总患病率大20.1％，严重威胁人群健康并带来沉重的经济负担。

目前骨质疏松症的治疗仍以健康教育和骨折处理为主，然而目前用于临床的多种药物多以抑制破骨细胞功能为主，但临床效果不满意，未来更看好以促进成骨的药物。但由于缺乏病因和致病机理的研究，还不能有效控制骨质疏松症的发生和发展。因此，深入研究骨质疏松症的病因和致病机理并探索新的治疗方法在我国有着非同寻常的意义。

骨质疏松症的发生是遗传和环境因素共同作用的结果，是一个复杂的多因子疾病。近年来，对于骨质疏松症遗传机制和相关基因的研究已经成为骨质疏松症病因学研究的热点和难点。此前国内外学者对骨质疏松症的相关基因开展了大量的研究，试图通过研究确定其直接病因；找到敏感的遗传标记，预测发生骨质疏松的危险性；开发药物防止骨量丢失和逆转骨质疏松。但是，其相关基因和致病基因仍然尚未明确，而致病机制还有待于更加深入和广泛的探索。

技术实现要素：

为了实现骨质疏松症的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种新的骨质疏松症相关基因，以及该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供该骨质疏松症相关基因及其表达产物在骨质疏松症早期筛查中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了用于骨质疏松症早期筛查的分子标记物，所述分子标记物为ZNF800基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。

更进一步地研究发现，所述ZNF800基因或该基因的表达产物在骨质疏松症患者生物学样本中表达上调。

进一步地，本发明提供了所述分子标记物在制备骨质疏松症早期筛查产品中的应用。

优选的，所述早期筛查产品包括基因水平的筛查产品和蛋白水平的筛查产品。

优选的，所述基因水平的早期筛查产品是通过real-time PCR、Northern blot、Southern blot、基因芯片、原位杂交或RNA酶保护实验方法来检测ZNF800基因的表达水平；所述蛋白水平的早期筛查产品是通过免疫检测、Western blotting或蛋白芯片来检测ZNF800基因表达产物的表达水平。

进一步地，本发明提供了一种用于骨质疏松症早期筛查的试剂，所述试剂包括检测ZNF800基因表达水平的寡聚核苷酸或检测ZNF800蛋白表达水平的抗体。

进一步地，本发明提供了一种用于骨质疏松症早期筛查的试剂盒，所述试剂盒包括检测ZNF800基因或ZNF800蛋白表达水平的试剂。

优选的，所述试剂盒包括检测ZNF800基因的引物或检测ZNF800蛋白的抗体。

优选的，所述检测ZNF800基因的引物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对。

优选的，所述试剂盒的组分包括：

(1)组织样本或血液中总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇和75％乙醇等。

(2)反转录试剂：逆转录缓冲液、M-MLV逆转录酶、热稳定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制剂和T重复寡核苷酸Oligo dT。

(3)定量PCR试剂：PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs组成的SYBR Green聚合酶链式反应体系，引物和RNase Free H₂O。

(4)正常标准品：所述的正常标准品采用正常人群中相应基因表达水平位于中位值的人群，以其相应基因通过特异性反转录引物扩增反转录成的cDNA作为标准品。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了一种与骨质疏松症相关的基因ZNF800，并进一步证实该ZNF800基因或该基因的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在骨质疏松症患者生物学样本中表达上调。利用该基因在人群中进行骨质疏松症的普查，解决了现有技术中筛查与诊断措施敏感性和特异性差的问题，能够快速有效的做到骨质疏松症的早期筛查与诊断，而且为预测诊断骨质疏松症的发生发展，甚至是为今后在生物学水平治疗骨质疏松症提供了治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1本发明中实施例2中骨质疏松症患者ZNF800基因表达上调；

图2本发明中实施例3中骨质疏松症患者ZNF800蛋白表达上调。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明的发明人对26例骨质疏松症患者样本及22例对照样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选基因ZNF800，现有研究中并没有ZNF800和骨质疏松症相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了ZNF800在骨质疏松症患者生物学样品中表达上调，其相关制剂可用于筛查骨质疏松症。

本发明的ZNF800基因是在本发明之前的已知基因，其基本信息如下：

Genbank登录号：NCBI GeneID：168850，来源于人类基因组。

ZNF800(zinc finger protein 800，锌指蛋白800，protein coding)，位于第7号染色体上。锌指蛋白是一类对基因调控起重要作用的转录因子，具有手指状结构域，参与细胞分化、胚胎发育，并与许多疾病的发生相关。ZNF800属于C2H2型锌指蛋白家族，包含7个C2H2型锌指，参与基因转录调控。

本发明还采用RT-PCR方法和Western-Blot方法检测上述基因在骨质疏松症患者和正常人群中的表达，并验证了该基因为骨质疏松症表达上调基因。

本发明的ZNF800基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本文使用的“骨质疏松症”未做说明时，一般特指原发性骨质疏松症。

本文使用的“对照”指未显示任何骨质疏松症症状(包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症)并且未诊断为骨质疏松症的个体或个体组。优选地，所述对照个体未使用影响骨质疏松症的药物。更优选地，对照个体具有与测试样本相比相似的性别、年龄和体重指标(BMI)。根据本发明，“对照”还指分离自正常个体的样品，包括分离自正常个体的总RNA或mRNA。取自对照个体的样品可包括分离自样本组织的RNA，其中RNA分离自样本组织，所述样本组织分离自组织移除时未诊断为骨质疏松症并且未显示任何骨质疏松症症状的个体。

本文使用的术语“生物学样品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、软骨、滑膜组织等样品。用于本发明的生物学样品得自任何受试者的任何组织样品(如骨组织、椎间盘、关节突、脊髓、椎旁肌或血样)或细胞样品(如成骨细胞、软骨细胞或血细胞样品)均可以根据本发明方法使用。可以从中获得这些样品并根据本发明方法使用这些样品的受试者实例包括但不限于无症状受试者、表现或更多骨质疏松症症状的受试者、临床诊断为患有骨质疏松症的受试者、易患骨质疏松症的受试者(如有骨质疏松症家族史的受试者、有骨质疏松症遗传易感性的受试者以及生活方式使其易感骨质疏松症或提高患骨质疏松症可能性的受试者)、怀疑患有骨质疏松症的受试者、正接受骨质疏松症治疗的受试者、患有骨质疏松症和非接受骨质疏松症治疗的受试者、开业医生(如医师)确定为健康或无骨质疏松症的受试者(即正常)、已治愈骨质疏松症的受试者、正在控制其骨质疏松症的受试者和未诊断为骨质疏松症的受试者。

在根据本发明方法使用前，任选地(但优选)将收集的生物学样品保存在低温如4℃下。在一些实施方案中，在第一时间根据本发明方法使用样品的一部分，而将一个或多个剩余的样品部分保存一段时间以备后用。该段时间可以是1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定。就长期保存而言，可以使用本领域熟知的保存方法，例如在冷冻温度(如低于-80℃)保存。在一些实施方案中，作为保存样品的补充或替代，将分离的核酸或蛋白质保存一段时间(如1小时或更长、1天或更长、1周或更长、1月或更长、1年或更长或不确定)以备后用。

实施例1高通量测序筛选差异表达基因

1、取样

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的骨质疏松症患者，病例组共收集26例，所有患者均有典型的临床表现，经骨密度(双能X线)检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集22例。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、对血液样本进行总RNA提取

采用Trizol LS(Invitrogen：10296-010)对采集的血液样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

取收集到的新鲜血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

(1)入1mLTrizol，室温保存5分钟；

(2)加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温放置3-5分钟；

(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的界面。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下8000rpm离心2分钟。弃去乙醇液体，室温下放置2分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；

(5)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

3、RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、高通量测序

测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC＞1或＜-1，FDR＜0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因ZNF800，该基因在骨质疏松症患者血液样本中表达上调。

实施例2 RT-PCR验证骨质疏松症患者及对照血液中ZNF800基因表达情况

1、材料

选取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的骨质疏松症患者10例，所有患者均有典型的临床表现，经骨密度(双能X线)检查确诊。对照来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集8例。采集所有研究对象的血液样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

2、方法

2.1对血液样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。

2.2逆转录合成cDNA

采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：

使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。

2.3Real-Time PCR

2.3.1仪器及分析方法

用ABI 7500型荧光定量PCR仪，用2-^△△CT法进行数据相对定量分析。

2.3.2引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI：NM_176814.4(ZNF800)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。引物序列如表1所示：

表1引物序列

操作过程如下：

(一)反应体系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95°5min，(95℃15sec，60℃退火45sec，72℃35sec)×40个循环。

表2RealTime反应体系

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTime-PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。

二、实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2^-△△Ct×100％，比较ZNF800基因在骨质疏松症患者血液中和对照组血液中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中ZNF800基因在骨质疏松症患者血液中的表达水平是对照组血液中的3.5倍，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析ZNF800基因在骨质疏松症患者中表达上调的结果。

实施例3WB方法检测骨质疏松症患者血液中ZNF800的蛋白表达水平

一、材料

收集10例行椎体后凸成形手术的骨质疏松症患者，术中获取骨质疏松症患者病变椎体骨组织，取样来源于2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科就诊的骨质疏松症患者，所有患者均有典型的临床表现，经骨密度(双能X线)检查确诊。对照来源于同时期住院的外伤致脊柱爆裂性骨折患者，共收集8例，获取正常椎体骨组织。采集所有研究对象的骨组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。

二、方法

1、蛋白样品制备及定量

1.1RIPA裂解液(Beyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下：

将骨组织样本自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将骨组织置于机械组织匀浆器中，1∶10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀浆，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液，按1∶1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。

1.2利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量

采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(CW2011)，步骤见说明书。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

1.1蛋白质样品变性：

(1)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5x)。

(2)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

1.2胶板制备：

采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5mL 10％的分离胶，配方如下：

表3分离胶配方

混匀后立即灌胶，然后加1mL蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2mL 5％的浓缩胶。

表4浓缩胶配方

混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1x蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。

1.3上样及电泳

将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满1x蛋白电泳缓冲液，外槽中1x蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

3、蛋白质印迹

(1)按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。

(2)预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海棉垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。

(3)封闭：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；

(4)一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(ZNF800polyclonal antibody(PAB21502-100UL))杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；

(5)回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；

(6)弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；

(7)弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；

(8)ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。

(9)以β-Actin作为内参进行数据标准化，以对照组正常关节突软骨组织样本中ZNF800作为参照样本，计算患者病变骨组织样本中ZNF800蛋白相对表达水平。

三、实验结果

如图2所示，与对照组正常骨组织样本中ZNF800相比，患者病变骨组织样本中ZNF800蛋白的表达量显著上调。

实施例4骨质疏松症检测试剂盒

基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于骨质疏松症早期筛查的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增ZNF800基因的引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表5所示：

表5PCR反应体系

最佳反应条件为：95°预变性5min，(95℃变性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。

利用上述试剂盒中的试剂对受试者样本进行RNA提取、反转录成cDNA、按照最佳反体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中的正常标准品作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测受试者样本中ZNF800的表达量相对正常人中ZNF800表达量的变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，判为检测样本阳性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。