一株解淀粉芽孢杆菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的应用的制作方法

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。

背景技术：

葡萄霜霉病是一种真菌病害。葡萄霜霉病的普遍发生造成了果实的大量减产，严重影响了果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低，严重制约了我国葡萄产业的发展。无论在发达国家，还是在发展中国家，由于缺少必要的有效防控药剂，葡萄霜霉病引起的损失量占总量的20％以上。葡萄霜霉病的发生已给现代葡萄生产尤其是高端葡萄产品生产与加工造成了严重影响。

葡萄霜霉病主要危害叶片，也能侵染新梢幼果等幼嫩组织。叶片发生葡萄霜霉病后，初生淡黄色水渍状边缘不清晰的小斑点，以后逐渐扩大为褐色不规则形或多角形病斑，数斑相连变成不规则形大斑；天气潮湿时，于病斑背面产生白色霜霉状物(即病菌的孢囊梗和孢子囊)；发病严重时病叶早枯早落。嫩梢发生葡萄霜霉病后，形成水渍状斑点，而后变为褐色略凹陷的病斑，潮湿时病斑也产生白色霜霉；病重时新梢扭曲，生长停止，甚至枯死。卷须、穗轴、叶柄有时也能发生葡萄霜霉病，其症状与嫩梢相似。幼果发生葡萄霜霉病后，病部褪色，变硬下陷，上生白色霜霉，很易萎缩脱落；果粒半大时受害，病部褐色至暗色，软腐早落；果实着色后不再侵染。

葡萄霜霉病的病原菌为葡萄霜霉菌，属鞭毛菌亚门、卵菌纲霜霉目、单轴霉属。葡萄霜霉病菌以卵孢子在病组织中越冬，或随病叶残留于土壤中越冬。次年在适宜条件下卵孢子萌发产生芽孢囊，再由芽孢囊产生游动孢子，借风雨传播，自叶背气孔侵入，进行初次侵染。经过7-12天的潜育期，在病部产生孢囊梗及孢子囊，孢子萌发产生游动孢子进行再次侵染。孢子囊萌发适宜温度为10℃～15℃。游动孢子萌发的适宜温度为18℃-24℃。秋季低温，多雨多露，易引起病害流行。果园地势低洼、架面通风不良树势衰弱，有利于病害发生。

2014年我国葡萄栽培面积已经超过80万公顷，超过法国，仅次于西班牙，是世界上葡萄有效种植面积第二大国，而且葡萄种植面积还在逐步增加。目前，葡萄霜霉病的普遍发生已成为制约我国葡萄产业发展的一个重要因素。目前生产中对葡萄霜霉病的防治仍然以化防为主，但由此带来的“3R”负面影响非常严重。化学农药的大量使用严重破坏了生态环境，导致葡萄果实中大量的农药残留，影响人们身体健康。在我国葡萄产区，在葡萄的采摘之前，对葡萄霜霉病的防治手段同样也是以化学农药为主，这不仅影响人民的身体健康，也限制了葡萄产品的加工与出口。我国已将发展生物农药和绿色食品列入了《中国21世纪议程》，北京现代农业科技城的建设要求北京市及周边地区作物病害实现绿色防控、农业产品实行绿色生产。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌及其在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB，已于2013年09月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.8179。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB CGMCC NO.8179，简称解淀粉芽孢杆菌KB。

解淀粉芽孢杆菌KB的培养物也属于本发明的保护范围。所述培养物的制备方法如下：将解淀粉芽孢杆菌KB接种至LB液体培养基，进行培养，得到培养物。所述培养物的制备方法具体如下：将解淀粉芽孢杆菌KB接种至LB液体培养基并使其在培养体系中的初始浓度为10⁵cfu/毫升，进行培养，得到培养物。所述培养的条件具体可为28-30℃、180-220rpm振荡培养48小时。所述培养物具体可为结束培养后的整个体系。

解淀粉芽孢杆菌KB的发酵物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物在抑制葡萄霜霉病菌中的应用。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物在防治葡萄霜霉病中的应用。

本发明还保护解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物在防治葡萄霜霉病菌引起的植物病害中的应用。所述植物具体可为葡萄，例如葡萄品种“红乳”。

本发明还保护一种抑制葡萄霜霉病菌的制剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物。

本发明还保护一种防治葡萄霜霉病的制剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物。

本发明还保护一种防治葡萄霜霉病菌引起的植物病害的制剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌KB或所述培养物或所述发酵物。所述植物具体可为葡萄，例如葡萄品种“红乳”。

芽孢杆菌(Bacillus spp.)在土壤中普遍存在，是存在于土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群之一，由于产生内生芽孢，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中因干燥、热和紫外辐射所造成的伤害，维持自身生存能力不受影响。这个生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，特别是在使用活菌制剂的生物制品中表现出强大的生命力。芽孢杆菌种类繁多，数量巨大，能够产生多种多样的生理活性物质和代谢产物，具有广泛的工业应用前景。

本发明提供了一株对葡萄霜霉病菌具有抑制作用的解淀粉芽孢杆菌，对于葡萄霜霉病的防治具有重大的应用价值。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌KB革兰氏染色后的照片。

图2为解淀粉芽孢杆菌KB在葡萄叶盘上对葡萄霜霉病菌的抑制效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)：黄晓庆，孔祥久等不同寄主来源的葡萄霜霉病菌致病力测定及孢子囊大小比较；《植物保护》,2015,41(3):178-182。

葡萄品种“红乳”：侯国杰，红乳葡萄；《北京农业》，2009，22期。

实施例1、解淀粉芽孢杆菌KB的获得、鉴定和保藏

一、菌株的获得

从中国北方有机果园中采集桃子和猕猴桃。从水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，分别在LB固体培养基、NA固体培养基、KB固体培养基和CM0002固体培养基上28℃培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的菌落，在LB固体培养基上纯化保存，并以葡萄霜霉病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的菌株，将其命名为菌株KB。

二、菌株的鉴定

参考《土壤微生物研究原理与方法》(林先贵.土壤微生物研究原理与方法[M]，高等教育出版社，2010)中描述方法进行生理生化和环境耐受性特性的测定。

菌株KB的形态学特征：菌体细胞在400倍光学显微镜下菌体细胞呈短杆状，直或近直，芽孢中生，柱状或椭圆形，具有运动性；在LB固体培养基上不产色素，菌落为白色不透明，扁平或圆形，无光泽，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱，变为乳脂色。

菌株KB的生理生化特征：革兰氏染色阳性(照片见图1)，形成菌膜，甲基红、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、吲哚反应、接触酶阳性、尿酶阳性，可水解明胶、纤维素、淀粉和七叶苷，氧化酶反应、分解酪氨酸阴性，产生硫化氢，利用柠檬酸盐，不利用丙二酸盐，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶反应阳性，苯丙氨酸脱氨酶反应阴性，葡萄糖、蔗糖产酸产气，可利用葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、半乳糖、肌醇、木糖、甘露糖、甘露醇、核糖、蔗糖等，不利用阿拉伯糖和山梨糖。

菌株KB的环境耐受性表现：于含有1％-7％(质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于含有10％(质量含量)氯化钠的培养基中不可生长；于pH4.5-9.0的培养基中均可正常生长，在pH4.0生长势弱，pH 9.5不可生长；在环境温度为4℃下生长势弱，在55℃-80℃下处理15min，仍可正常生长。

菌株KB产嗜铁素、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶。

菌株KB的16S rDNA序列如序列表的序列1所示。

综合上述结果，将菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

三、菌株的保藏

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB，已于2013年09月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.8179。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KB CGMCC NO.8179，简称解淀粉芽孢杆菌KB。

实施例2、菌株的抑菌活性

1、采集葡萄品种“红乳”的新鲜叶片，先用自来水冲洗，然后用75％乙醇水溶液消毒30秒，然后用无菌水冲洗，然后用打孔器打孔，获取直径1.5cm的叶盘。

2、取步骤1得到的叶盘，放置于铺有无菌纱布的培养皿中，将培养皿置于无菌操作台中，吹4-5分钟。

3、分组处理

试验组：完成步骤2后，取叶盘，在生防菌菌液中浸泡30-60秒。

生防菌菌液的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌KB接种至LB液体培养基(初始菌浓度10⁵cfu/毫升)，28-30℃、180-220rpm振荡培养48小时，取整个体系，4℃下保存备用。

对照组：完成步骤2后，取叶盘，在无菌水中浸泡30-60秒。

4、完成步骤3后，取叶盘，放置于铺有无菌纱布的培养皿中(叶盘背面向上)，将培养皿置于无菌操作台中，吹1-2分钟。

5、完成步骤4后，取叶盘，每个叶盘在背面接种20μl病原菌菌液(用无菌水悬浮葡萄霜霉病菌的孢子，得到菌浓度为10⁴cfu/ml的病原菌菌液)，放置5-10分钟，然后置于22℃、80-90％相对湿度、光暗交替(光照12小时/黑暗12小时)的环境中培养10天。观察叶盘葡萄霜霉病发病情况，根据未发病的叶盘数占总接种叶盘数的多少，计算病害抑制率。

进行五次重复试验，每次重复试验中设置五个重复处理，结果取平均值。

培养10天后的照片见图2。试验组的病害抑制率为100％。结果表明，解淀粉芽孢杆菌KB对葡萄霜霉病菌具有较好的抑制功能。

序列表

<160> 1

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 1

gtaaagggcg gggtgctata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac ataaatggtg 180

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