一种改性胶原及其制备方法与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种改性胶原及其制备方法。

背景技术：

牙科手术中常需要应用引导骨再生手术进行骨增量。胶原是细胞外基质的一种成分，已经广泛应用于引导骨再生术中。胶原膜有较好的生物兼容性，并能促进成骨细胞黏附、增殖、迁移和分化，也能有阻挡成纤维细胞快速入侵骨组织生长位点、隔开软组织与硬组织的生长等屏障功能。

然而，作为一种外源性移植物，胶原仍然会引起一定的炎症反应，同时也因为它的易降解性而缺乏较好的机械性能。本领域常用采用戊二醛与胶原进行交联，从而提高它的机械性能，但容易引发炎症和产生细胞毒性。因此，胶原膜长期的保存和使用，不仅仅需要提高机械性能，更要抗炎和提高生物兼容性。

茶多酚（Catchine）是一种来自绿茶的多酚，它拥有众多生物学功能，近年来广受关注。科学家们发现，茶多酚拥有抗癌、抗氧化、抗炎症、抗纤维化和促进成骨的作用。同时，它也可以作为一种胶原的改性剂，Chu等人报道其既可以增强胶原的机械性能，也不会破坏胶原的三股螺旋结构。因此，EGCG-胶原复合膜可以用于引导骨再生等手术中，并拥有良好的前景。

近期Sadtler等报道，胶原具有诱导修复型巨噬细胞的作用，可以促进M2（修复型巨噬细胞）细胞的聚集以及mTOR介导的修复型通路，进而促进肌肉组织的修复。

本发明将茶多酚结合胶原膜，想缓解由于异物导致的炎症反应，同时诱导修复型巨噬细胞的聚集，进而促进组织修复。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种改性胶原及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种改性胶原，制备方法如下：

A、以培养板为模具，取胶原蛋白2ml，加入浓度为10%w/v醋酸溶液中制备胶原膜；

B、按照1000mg：1ml的比例将制备的300mg胶原膜置于0.64％w/v茶多酚溶液中预交联，浸泡于含0.64％w/v茶多酚的0.05 mol／L醋酸溶液，交联，清洗，干燥后即得。

作为优选，所述胶原蛋白为牛来源I型胶原。

作为优选，所述步骤A中，在-20℃温度下冷冻过夜，在-53℃、1 Pa条件下，真空冷冻干燥24h。

作为优选，所述步骤B中，预交联时间为10-60min。

作为优选，所述步骤B中，交联时间为24h。

作为优选，所述步骤B中，将制备好的茶多酚-胶原复合膜于-20℃条件下冷冻干燥过夜。

本发明的优点在于：本发明所制备的改性胶原拥有更好的能力诱导修复型巨噬细胞的聚集，提高了胶原膜的生物性能，降低了药物-胶原复合膜的生物毒性，具有很好的应用前景，为引导再生术等相关增量手术提供了新选择。

附图说明

图1是实施例3流式细胞术实验结果图。

图2是实施例3聚合酶链式反应实验结果图。

图3是实施例3聚合酶链式反应实验结果图。

图4是实施例3HE染色实验结果图。

图5是实施例3Masson染色实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：以直径为3.5cm／孔的培养板为模具，加入胶原蛋白2mL于浓度为10%（w/v）醋酸溶液。-26℃低温冰箱冷冻过夜，在-53℃、1Pa条件下，冻干机真空冷冻干燥24h，制备胶原膜。

2.茶多酚（0.64%）梯度浓度溶液配制。

3.茶多酚改性的胶原膜

将制备的胶原膜置于0.64％茶多酚中预交联10 min后，浸泡于含0.64％茶多酚的0.05 mol／L醋酸溶液，于4℃交联24 h，l X PBS缓冲液漂洗3次。

将制备好的胶原膜于-20℃条件下冷冻干燥过夜。

实施例2：一种改性胶原，制备方法如下：

A、以培养板为模具，取胶原蛋白2ml，加入浓度为10%w/v醋酸溶液中制备胶原膜；

B、按照1000mg：1ml的比例将制备的300mg胶原膜置于0.64％w/v茶多酚溶液中预交联，浸泡于含0.64％w/v茶多酚的0.05 mol／L醋酸溶液，交联，清洗，干燥后即得。

所述胶原蛋白为牛来源I型胶原。

所述步骤A中，在-20℃温度下冷冻过夜，在-53℃、1 Pa条件下，真空冷冻干燥24h。

所述步骤B中，预交联时间为10-60min。

所述步骤B中，交联时间为24h。

所述步骤B中，将制备好的茶多酚-胶原复合膜于-20℃条件下冷冻干燥过夜。

实施例3：生物兼容性试验

1.流式细胞术

将6-8周龄的雄性SD大鼠（重250-300g）27只随机分为9组，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，在每只大鼠背部造3个长1mm的切口，植入相应的材料（1mm，圆形）后以3-0的不可吸收尼龙缝线缝合创口。在第三天、第五天、第七天以颈椎脱位法分别处死老鼠，以1mm切口为直径环状取下全层皮肤组织，随即以PBS冲洗，剪碎后加入I型胶原酶、II型胶原酶（0.25mg/ml）在36.5摄氏度的环境下消化组织，2小时后以细胞筛网过滤组织悬液，在每分钟1300转速下离心3分钟，再以PBS冲洗，随即在冰上加入CD206抗体，避光孵育半小时后，在每分钟1300转速下离心3分钟，倒去悬液后再加入PBS以及FITC标记的二抗，在冰上孵育半小时后，在每分钟1300转速下离心3分钟，倒去悬液后再加入PBS，随即上机进行流式细胞术检测。

如图1所示，流式细胞术检测材料植入大鼠皮下CD206阳性（修复型巨噬细胞标志物）的比例，结果提示：相较于对照组及应用了胶原膜的组别，茶多酚改性的胶原膜显著诱导了更多修复型巨噬细胞。

2. 实时定量聚合酶链式反应(qPCR)

如图2所示，材料植入大鼠颅顶骨缺损（圆形，直径：5mm）显著提升了CD163、CD206（修复型巨噬细胞标志物）的表达，以及bmp2、runx2、opn、col1a1（成骨相关基因）。

如图3所示，材料植入大鼠颅顶骨缺损（圆形，直径：5mm），相对于胶原膜组（Col），茶多酚改性的胶原膜（E-Col）明显促进修复相关的生长因子基因的表达,其中包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生因子(PDGF-A、PDGF-B)、胰岛素样生长因子（IGF-1）、转化生长因子-β（TGF-β）的表达。

3. HE染色

如图4所示，茶多酚改性的胶原膜组别植入大鼠颅顶骨缺损（圆形，直径：5mm），明显促进骨再生。

4. Masson染色

如图5所示，茶多酚改性的胶原膜组别明显促进胶原的沉积。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。