本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种糖基化终末产物的简易制备方法。
背景技术：
糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一个全球性的公共健康问题，其患病人数已从1980年的1亿左右增长到今天的近5亿，而中国的DM发病率还要明显高于世界的平均水平。各种原因引起的胰岛β细胞受损胰岛素合成分泌减少，或胰岛素的信号通路障碍，导致了葡萄糖的储存和利用减少，血糖水平持续升高并出现尿糖，这是DM发生的主要原因。包括葡萄糖和果糖在内的一系列还原糖在代谢过程中会产生大量高活性的二羰基化合物，如丙酮醛(methylglyoxal,MGO)。这些化合物常与生物大分子(如蛋白质、核酸等)结合，形成糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)，损害组织器官的功能状态。这种效应也是体内“高血糖记忆”的主要原因，即血糖含量虽已经控制在正常水平，但是DM引起的损伤可在一段相当长的时间存在。目前，在DM的建模方面，主要采用以下方法：①用高糖和/或高脂饲养动物模拟人的2型DM发病过程，②将瘦素基因进行纯合突变获得ob/ob的2型DM小鼠，③筛选自发性瘦素受体突变的小鼠可得到db/db的2型DM小鼠，④用化学药物(如链脲佐菌素，四氧嘧啶等)选择性地损害实验动物的胰岛β细胞从而造成1型DM模型，⑤用高糖、MGO或AGEs处理细胞可以制备DM的细胞模型。对于建模方法⑤，使用AGEs要比高糖和MGO更能模拟DM的真实过程，研究结果也更具说服力。对于AGEs，传统方式采用葡萄糖或果糖和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)反应制备，然而，这种方法周期较长，制备率较低，往往导致实验结果不稳定。
AGEs是建立2型DM体外细胞模型和整体动物实验模型的关键试剂，然而，市面上提供AGEs的商业化试剂公司较少。另外，个别提供AGEs的试剂公司对其要价极高，如BioVision公司提供的AGEs(No.2221-10)每10mg售价295美元。如此高的价格在某种程度上限制了它的广泛应用。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供AGEs的一种简易制备方法，该方法用相对较便宜的动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，生产出含量高，质量稳定的AGEs，显著的降低了AGEs的价格。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种糖基化终末产物的简易制备方法包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50-70g/L，获得动物血清蛋白溶液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；丙酮醛-动物血清蛋白反应液中丙酮醛的浓度为0.6-10mM；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气并搅拌混匀一次，反应时间为3-7天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化，获得糖基化终末产物。
优选地，步骤3)所述对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行纯化具体为采用透析袋对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析，去除游离的丙酮醛。
优选地，还包括步骤4)，具体为对透析后的糖基化终末产物溶液进行含量测定。
优选地，步骤4)所述含量测定的方法为对比糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色差异；若与动物血清蛋白溶液相比，糖基化终末产物溶液颜色变为棕色则表明生成了糖基化终末产物，颜色越深则表明糖基化终末产物含量越高。
优选地，步骤4)所述含量测定的方法为：对糖基化终末产物溶液与动物血清蛋白溶液的颜色分别进行灰度分析，利用假设检验获得P值，当P值小于0.05表明已生成糖基化终末产物。
优选地，步骤4)所述含量测定的方法为：采用荧光酶标仪对糖基化终末产物溶液进行含量检测，检测所用激发波长340nm，发射波长465nm。
优选地，步骤1)所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤1)所述的动物血清蛋白为牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种。
优选地，一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为50-70g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为10mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物；
4)采用荧光酶标仪对糖基化终末产物溶液进行含量检测，检测所用激发波长340nm，发射波长465nm。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明采用相对较便宜的动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，生产出含量高，质量稳定的AGEs，显著的降低了AGEs的价格。
2.本发明通过采用动物血清蛋白和丙酮醛作为原料，制备AGEs，该方法操作简单，不需采用大型昂贵精密仪器，容易实现，具有易于操作、应用范围广的优点。
附图说明
图1为本发明的定性定量检测图。
其中图1包括A部分、B部分、C部分。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1：
一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为0.6mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。
实施例2：
一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为1.2mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。
实施例3：
一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为2.5mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。
实施例4：
一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为5mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。
实施例5：
一种糖基化终末产物的简易制备方法，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)向所获得的动物血清蛋白溶液里加入丙酮醛至丙酮醛的浓度为10mM，获得丙酮醛-动物血清蛋白反应液；
3)将丙酮醛-动物血清蛋白反应液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使丙酮醛-动物血清蛋白反应液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对丙酮醛-动物血清蛋白反应液进行透析除去游离的丙酮醛，获得糖基化终末产物。
对照组实施例
糖基化终末产物的简易制备方法的对照组，包括如下步骤：
1)配制磷酸盐缓冲液，将动物血清蛋白加入到所配制的磷酸盐缓冲液中至浓度为60g/L，获得动物血清蛋白溶液；所述动物血清蛋白为牛血清白蛋白；所述配制磷酸盐缓冲液具体为：分别称取KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.61g、KH2PO4 0.2g和NaCl 8.0g，加DI-H2O 800mL，待其完全溶解，定容至1000mL，调节pH至7.4，过滤除菌获得磷酸盐缓冲液；
2)与实施例1-5的区别在于本步骤不向动物血清蛋白溶液中添加丙酮醛；
3)将动物血清蛋白溶液装入容器中，放置在37℃环境中，每12h打开容器使动物血清蛋白溶液接触空气，并搅拌混匀一次，反应时间为3天；反应后，对动物血清蛋白反应液进行透析，获得对照组溶液。
检测AGEs实施例
对实施例1-5所获得的AGEs溶液和对照组实施例所获得的对照组溶液分别采用如下方法进行AGEs检测：
方法一：对比糖基化终末产物溶液(实施例1-5)与动物血清蛋白溶液(对照组)的颜色差异；若与动物血清蛋白溶液相比，糖基化终末产物溶液颜色变为棕色则表明生成了糖基化终末产物，颜色越深则表明糖基化终末产物含量越高。结果如图1的A部分所示，具体为从左往右的EP管代表对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5。
方法二：对糖基化终末产物溶液(实施例1-5)与动物血清蛋白溶液(对照组)分别进行灰度分析，利用假设检验检测每个实施例是否与对照组有显著差异，获得P值，当P值小于0.05表明已生成糖基化终末产物。结果如图1的B部分所示，具体为从左往右的每根柱子代表对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5。
方法三：采用荧光酶标仪对糖基化终末产物溶液的平均荧光强度(MFI)进行检测，检测所用激发波长340nm，发射波长465nm。结果如图1的C部分所示，具体为从左往右的每根柱子代表对照组、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、MGO溶液。
在图1的B部分和图1的C部分中，*表明*为P<0.05vs对照组,**为P<0.01vs对照组。在本发明图1的A部分显示，随着MGO在溶液中的浓度不断增加，棕色的颜色不断加深。进一步的灰度分析半定量结果显示(图1的B部分)，2.5mM,5mM,10mM MGO组与单独BSA组比较差异具有统计学意义,P值分别小于0.05,0.01,0.01，具有剂量依赖关系。进一步应用更为灵敏的荧光法(激发波长340nm，发射波长465nm)进行检测AGEs的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)，结果如图1的C部分显示，在0.6mM～10mM的浓度范围内，MGO也可使反应液的MFI明显增加(P均<0.01)。另外，10mM MGO本身并未产生明显的荧光，提示反应体系中荧光信号的增加是因为生成了AGEs的缘故。值得注意的是，5mM MGO基本达到最大的MFI，提示BSA结合MGO可能趋向于达到饱和。以上数据表明，本发明采用用BSA和MGO共同孵育的方法能够制备出AGEs；提供了一种成本低廉、操作简单的AGEs制备方法。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变或修正，而所有的这些改变或修正都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。