本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种噻吩并[3,2-d]嘧啶类egfr/erbb2双靶点抑制剂及其制备方法。本发明提供的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物对egfr和erbb2蛋白酪氨酸激酶均具有明显的抑制作用，可作为抗肿瘤药物或先导化合物。
背景技术：
癌症是严重威胁人类生命健康的最主要疾病之一，攻克癌症一直是举世瞩目的研究课题。半个多世纪以来，癌症化疗取得了长足的发展，其中细胞毒性类药物对一些类型的肿瘤表现出良好疗效，而且在当前和今后相当长的一段时期内传统细胞毒性药物仍将是癌症化疗药物的主体。然而，细胞毒性药物存在着毒副作用大、选择性差、易产生耐药性等主要缺陷致使其对大多数类型肿瘤的疗效尚难令人满意。因此，临床上迫切需要寻找高效、低毒、特异性好的抗肿瘤药物。
随着肿瘤生物学及相关学科的飞速发展，人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致细胞无限增生，随之带来抗肿瘤药物研发理念的重大转变，正从传统细胞毒性类药物向针对肿瘤发生发展过程中众多环节的新药方向发展，特别是靶向药物能针对正常细胞与肿瘤细胞之间的差异，达到选择性强、高效低毒的治疗效果，从而克服传统细胞毒性药物的选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点，使恶性肿瘤进入“靶向治疗”新时代。近年来，以蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinases,ptks)为靶点进行药物研发已成为国际抗肿瘤药物研究的热点，其中，表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)家族是一类主要的蛋白酪氨酸激酶，包括egfr(erbb1)、erbb2、erbb3、erbb4等四个成员，其胞内区有atp结合位点，egfr类抑制剂可以竞争性与atp结合位点相结合，从而抑制egfr的磷酸化过程，阻断下游信号的传导，进而抑制肿瘤细胞的生长、分化和转移。egfr作为抗肿瘤靶点的生化过程正在被逐步阐明，其晶体结构和活性部位也已经比较清楚，以此为靶点的吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)和拉帕替尼(lapatinib)等芳胺基喹唑啉类药物已经应用于临床，egfr类抑制剂的研究方兴未艾。
肿瘤发生的原因和机制非常复杂，往往涉及多种蛋白结构和功能的变化，试图通过单靶点药物阻断某个受体来阻断肿瘤细胞信号转导并不全面，疗效往往也不够乐观，有可能引起耐药性。因此，研发多靶点抗肿瘤药物是解决“靶向治疗”诸多问题的一条有效途径。多靶点药物能同时作用于某一疾病相关病原体的多个分子靶点，与现在临床上常用的细胞毒性药物相比，多靶点药物具有高效、低毒、特异性高且不易产生耐药性等优点。随着肿瘤发生机制的逐步揭示，“多靶向”将为肿瘤治疗开辟一片新的天地。
技术实现要素：
本发明提供一种噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物及其制备方法和用途，所述化合物对egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶具有抑制活性。
本发明的技术方案如下：
一种通式(1)所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中，
r1选自c1-6烷基、芳基、c1-6烷基芳基；
r2相同或不同，选自h、卤素、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤代c1-6烷基、卤代c1-6烷氧基、c2-6烯基、c2-6炔基、硝基、氨基，或者两个相邻的r2与所连接的碳一起形成3-8元环，
n为0到5的整数。
根据本发明，所述烷基指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，优选烷基的实例为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基。
根据本发明，所述烯基指具有2-6个碳原子的直链或支链烯基，优选烯基的实例为乙烯基、丙烯基或异丙烯基。
根据本发明，所述炔基指具有2-6个碳原子的直链或支链炔基，优选炔基的实例为乙炔基、丙炔基、丁炔基。
根据本发明，所述烷氧基指具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基。
根据本发明，所述卤素为氟、氯、溴、碘，优选为氟、氯、溴。
根据本发明，所述芳基指具有6-20个(优选6-14个)碳原子的单环或多环芳族基团，代表性的芳基选自：苯基、萘基、蒽基等。
根据本发明，所述两个相邻的r2与所连接的碳一起形成的环可以为碳环或者杂环，所述杂环的杂原子可为n、o、s。
根据本发明的优选技术方案，r1选自c1-3烷基、芳基、c1-3烷基芳基；r2选自h、卤素、c1-3烷基、c1-3烷氧基、卤代c1-3烷基、卤代c1-3烷氧基、c2-3烯基、c2-3炔基，两个相邻的r2与所连接的碳一起形成3-6元环；n为1，2，3。
根据本发明更优选的技术方案，r1为苯基；r2为h、f、cl、br、甲氧基、三氟甲基、乙炔基，或者两个相邻的r2与所连接的碳一起形成二氧杂环戊烷。
优选的，所述通式(1)化合物选自如下具体化合物：
根据本发明，通式(1)化合物可以与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。其中术语“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸形成的盐，如盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、及其类似盐；也包括与有机酸形成的盐，如乳酸盐、草酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、醋酸盐，及其类似盐。
本发明还提供一种制备通式(1)化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，包括：
其中，r1、r2、n如上所述，r3为c1-6烷氧基；
1)将式(4)化合物与式(6)化合物进行反应，得到式(5)化合物；
2)将步骤1)中得到的式(5)化合物在碱性条件下进行反应，得到式(1)化合物；
3)任选地，将步骤(2)得到的化合物进一步与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。
根据本发明，对于步骤1)，所述反应在酸性条件下进行，例如冰醋酸。所述反应温度优选为50-150℃，更优选60-120℃。优选的，加热方式可以为普通加热或微波加热。
根据本发明，对于步骤2)，所述碱可以为无机碱，例如氢氧化锂、氢氧化钠等，所述反应在溶剂下进行，例如在醇类溶剂(如乙醇)中。所述反应温度优选为50-150℃，更优选60-120℃。
根据本发明，所述式(4)化合物可以通过如下方法制备，所述方法包括：
其中，r1如上所述，r3为c1-6烷氧基。
本发明还提供一种药物组合物，其包括上述通式(1)所述的化合物或其药学上可接受的盐。
根据本发明，所述药物组合物还包括至少一种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体或稀释剂；优选的进一步包含一种或多种选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、防腐剂和包衣材料的药学可接受的辅助材料。
根据本发明，所述药物组合物可制成制剂形式，例如固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂等。
根据本发明，所述的制剂可为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、颗粒剂、口服溶液剂、注射用水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明还提供一种上述通式(1)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抑制egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶药物中的应用。
本发明还提供了一种上述通式(1)化合物或其药学上可接受的盐在制备用于抗肿瘤或癌症药物中的应用。
本发明所述的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物合成路线短、制备方法简单、原料来源方便、易于实现工业化。这些化合物对egfr和/或erbb2蛋白酪氨酸激酶均具有明显的抑制作用，与商品化双靶点抗肿瘤药物bibw2992的活性相当。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。以下实施例中，1hnmr和13cnmr采用brukeravance400型超导核磁共振仪进行测试。
本发明化合物的合成路线如下：
实施例1式(1-1)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
1)在150ml圆底烧瓶中将11.31g(0.10mol)氰基乙酸乙酯和5.61g(0.10mol)koh溶解在50ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，0～5℃下搅拌3h，缓慢滴加13.52g(0.10mol)异硫氰酸苯酯，1h内加完，冰水浴下继续搅拌3h。然后，缓慢滴加7.55g(0.10mol)氯乙腈的dmf溶液，1h加完，室温下搅拌过夜。反应完毕，将反应液倒入100g碎冰中，析出大量黄色固体，抽滤、少量甲醇洗涤、干燥得棕色固体即为式(2’)所示化合物(产率为65％)，
2)于150ml圆底烧瓶中将2.87g(0.01mol)式(2’)所示化合物和1.98g(0.03mol)乙醇钠溶解在50ml无水乙醇中，回流反应3h。冷却至室温，将反应液加入到100ml蒸馏水中，静置析出大量黄色固体，抽滤、干燥，无水乙醇重结晶得黄色晶体为式(3’)所示化合物(产率为60％)，
3)在100ml圆底烧瓶中加入2.87g(0.01mol)式(3’)所示化合物和1.19g(0.01mol)n,n-二甲基甲酰胺二甲缩醛(dmf-dma)和15ml无水乙腈，回流反应2h。减压浓缩，无水乙腈重结晶得无色晶体为式(4’)所示化合物(产率为82％)，
4)取3.42g(0.01mol)式(4’)所示化合物和0.93g(0.01mol)苯胺溶解在50ml冰醋酸中，回流反应3h(替换的反应条件：微波加热，功率100w，温度125℃，反应30min)。反应完毕，冷却至室温，将反应液加入100ml蒸馏水中，析出大量固体。抽滤、水洗、干燥，dmf重结晶得无色晶体为式(5-1)所示化合物(产率为85％)，
5)在150ml圆底烧瓶中加入3.90g(0.01mol)式(5-1)所示化合物、2.39g(0.10mol)氢氧化锂和50ml的70％乙醇，90℃下反应4h。冷却至室温，将反应液加入到100ml蒸馏水中，用10％稀盐酸调节ph呈中性，析出大量固体，柱色谱分离(硅胶，展开剂：v石油醚:v乙酸乙酯＝2:1)得白色固体即为式(1-1)所示化合物(产率为73％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.22(s,1h,nh),10.81(s,1h,nh),8.71(s,1h,pyrimidylh),7.44-7.15(m,10h,ar-h),6.75(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:160.92,154.21,149.76,147.88,140.76,137.48,130.18,129.25,126.29,124.87,124.56,119.70,102.95,93.77。
实施例2式(1-2)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-氟苯胺代替苯胺，从而制得式(1-2)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为71％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.26(s,1h,nh),10.88(s,1h,nh),8.77(s,1h,pyrimidylh),7.46-7.18(m,9h,ar-h),6.75(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:163.52,161.17,153.79,150.17,148.05,140.71,139.77,130.81,130.24,124.71,119.84,119.62,112.29,110.91,103.79,93.77。
实施例3式(1-3)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-氯苯胺代替苯胺，从而制得式(1-3)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为75％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.42(s,1h,nh),8.49(s,1h,pyrimidylh),8.02-7.03(m,9h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.35,155.31,154.48,153.35,142.10,141.90,133.22,130.53,130.04,122.72,122.48,120.65,119.63,118.28,105.91,101.03。
实施例4式(1-4)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-氯-4-氟苯胺代替苯胺，从而制得式(1-4)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为72％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.41(s,1h,nh),8.47(s,1h,pyrimidylh),8.12-7.03(m,8h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.27,155.27,154.43,153.34,152.04,142.11,137.57,130.01,122.83,122.69,121.75,1119.30,118.25,117.10,105.62,101.04。
实施例5式(1-5)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-溴苯胺代替苯胺，从而制得式(1-5)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为74％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.92(s,1h,nh),9.40(s,1h,nh),8.49(s,1h,pyrimidylh),8.14-7.03(m,9h,ar-h),6.64(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.35,155.31,154.49,153.33,142.10,142.04,130.84,130.04,125.38,123.47,122.72,121.74,120.03,118.27,105.90,101.02。
实施例6式(1-6)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-甲氧基苯胺代替苯胺，从而制得式(1-6)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为72％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.21(s,1h,nh),10.78(s,1h,nh),8.73(s,1h,pyrimidylh),7.45-6.85(m,9h,ar-h),6.74(s,1h,thienylh),3.78(s,3h,och3)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:161.06,159.90,154.22,149.70,147.79,140.73,138.59,130.22,130.07,124.65,119.78,116.96,111.75,110.66,102.99,93.63,55.71。
实施例7式(1-7)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3,4-亚甲二氧基苯胺代替苯胺，从而制得式(1-7)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为68％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.93(s,1h,nh),9.20(s,1h,nh),8.37(s,1h,pyrimidylh),7.36-6.91(m,8h,ar-h),6.61(s,1h,thienylh),6.03(s,2h,och2o)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:161.87,154.89,154.52,154.22,147.37,143.89,142.26,133.81,129.97,122.43,118.01,116.27,108.24,105.46,104.86,101.51,100.88。
实施例8式(1-8)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-三氟甲基苯胺代替苯胺，从而制得式(1-8)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为69％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.94(s,1h,nh),9.56(s,1h,nh),8.50(s,1h,pyrimidylh),8.23-7.04(m,9h,ar-h),6.65(s,1h,thienylh)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.40,155.41,154.46,153.33,142.09,141.25,130.06,130.04,129.83(q,2jf-c＝31hz,c-cf3),126.10(q,1jf-c＝270hz,cf3),124.63,122.75,118.97,118.31,117.17,105.97,101.02。
实施例9式(1-9)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备
制备方法基本与实施例1所述的方法相同，不同的是，步骤4)中用3-乙炔基苯胺代替苯胺，从而制得式(1-9)所示的噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物(最后一步的产率为70％)，
1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.90(s,1h,nh),9.35(s,1h,nh),8.47(s,1h,pyrimidylh),7.97-7.02(m,9h,ar-h),6.63(s,1h,thienylh),4.20(s,1h,≡ch)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:162.27,155.18,154.53,153.51,142.13,140.49,130.03,129.37,126.27,124.34,122.67,122.19,118.22,105.75,101.06,84.12,80.94。
实施例10：体外激酶抑制活性筛选
实验方法：
(1)实验目的
实验采用化学发光法(chemicalluminescenceassay)测试本发明化合物样品对egfr和erbb2两种激酶的抑制率，所测试化合物采用系列梯度稀释浓度测试ic50值，实验采用erlotinib及bibw2992作为阳性对照药。
(2)实验材料
实验试剂均为市面上购置，见表1。
表1实验试剂
(3)实验仪器及耗材
96孔酶标板：corning公司，平底型；酶标仪：biotek公司，synergy2microplatereader型；振荡器：江苏新康医疗器械有限公司，xk96-3型；低速离心机：上海安亭科学仪器厂，tgl-16b型；恒温箱：天津通利信达仪器厂，fcd-3000型。
(4)实验步骤
①用dmso将样品溶解为10mm的母液。egfr激酶检测时，将样品用dmso稀释为1mm，然后用10％的dmso水溶液稀释为10μm，接着用10％的dmso水溶液对样品进行5倍梯度稀释，共10个浓度；erbb2激酶检测时，将样品用dmso稀释为1mm，然后用10％的dmso水溶液稀释为100μm，接着用10％的dmso水溶液对样品进行5倍梯度稀释，共10个浓度；
②配制1×的激酶测定缓冲液(kinaseassaybuffer：40mm的tris,ph7.4,10mm的mgcl2,0.1mg/ml的bsa,1mm的dtt)；
③在96孔酶标板中加入5μl的poly(glu,tyr)(终浓度为0.2mg/ml)到每孔中，之后每孔再加入5μl的atp溶液(终浓度为10μm)；
④接着每孔加入30μl的激酶测定缓冲液(kinaseassaybuffer)到孔中，再把5μl待筛选的样品溶液加入到每孔中，微板震荡器上进行混匀3min；
⑤然后每孔加入5μl的激酶，再混匀3min；
⑥在30℃避光反应30min；
⑦最后每孔加入50μl的激酶-glo测定缓冲液(kinase-gloassaybuffer)，反应5min；
⑧把96孔酶标板放入化学发光检测酶标仪中检测，数值代入以下公式：
％活性＝{(lut-lu)/(lut-luc)}×100％
其中，lu：为各浓度样品孔的化学发光值；
lut：为不含激酶的本底孔的化学发光值；
luc：为不含样品的溶剂对照孔的化学发光值；
⑨用prismgraphpad软件计算ic50值。
化合物对egfr和erbb2两种激酶的抑制ic50见表2。实验结果表明，本发明的化合物对egfr和erbb2激酶具有明显的抑制活性，尤其是化合物(1-9)的活性略优于商品化的egfr抑制剂erlotinib，与商品化的egfr/erbb2双靶点抗肿瘤药物bibw2992相当，因此可用于治疗含有上述靶点的肿瘤。
表2
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的思想和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。