一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsJ11及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsJ11及其编码基因与应用。

背景技术：

土壤盐碱化严重影响了陆地生态并严重制约了全球农业生产力，现已成为世界性的环境问题。据统计，我国盐碱化土地面积达9913万hm²，约为世界盐碱化土地的10％。我国东北地区是世界三大盐碱土分布区之一，占地达7.66×10⁶hm，且盐碱土面积以每年1.4％的速度增加。东北地区盐碱土中的主要盐分是碱性盐(NaHCO₃和Na₂CO₃)，相比于中性盐(NaCl和Na₂SO₄)所造成的渗透胁迫和离子胁迫外，碱性盐还包含CO₃^2-及HCO₃^-产生的高pH伤害，危害更复杂、更具生态破坏力。因此，开展作物抗盐碱、耐盐碱性研究，提高作物的耐盐碱性，是农业进一步增产增收的重要基础，对开发和利用大面积盐碱化土地具有重要意义。

DnaJ/Hsp40(热激蛋白40)是一类辅助伴侣分子，含有一个高度保守的约70个氨基酸左右的J结构域，可通过该结构域结合并调节Hsp70蛋白，共同组成Hsp70分子伴侣机器，促进蛋白的折叠与解折叠，使蛋白恢复正确构象，帮助植物抵御生物及非生物胁迫。此外，分子伴侣DnaJ对于蛋白的翻译、转运及降解也具有着重要作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物抗逆性相关蛋白，本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为GsJ11，为如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由158个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsJ11蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与GsJ11蛋白相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GsJ11蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列1由477个核苷酸组成，编码序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsJ11蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsJ11蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsJ11蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GsJ11蛋白的核酸分子的表达盒(GsJ11基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsJ11蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsJ11转录的启动子，还可包括终止GsJ11转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”,Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GsJ11基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了GsJ11蛋白或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了GsJ11蛋白或上述相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

本发明还提供了GsJ11蛋白或上述相关生物材料在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。

上述应用中，所述抗逆性为抗碳酸盐胁迫，所述抗碳酸盐胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫，体现为在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因植物的萌发率高于受体植物、转基因植物的根长长于受体植物、转基因植物的生长状态优于受体植物、转基因植物的叶绿素含量高于受体植物及转基因植物的丙二醛含量低于受体植物。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括在受体植物中过表达GsJ11蛋白，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述过表达的方法为将GsJ11蛋白的编码基因导入受体植物。

上述方法中，所述GsJ11蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本发明的实施例中，所述GsJ11蛋白的编码基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通过重组载体pCAMBIA330035Su-GsJ11导入所述受体植物中，所述重组载体pCAMBIA330035Su-GsJ11为在pCAMBIA330035Su载体中插入如序列表中序列1所示的GsJ11基因。pCAMBIA330035Su-GsJ11表达序列表中序列2所示的蛋白质。

上述方法中，所述抗逆性为抗碳酸盐胁迫，所述抗碳酸盐胁迫具体为抗NaHCO₃胁迫，体现为在NaHCO₃胁迫的条件下：转基因植物的萌发率高于受体植物、转基因植物的根长长于受体植物及转基因植物的生长状态优于受体植物。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsJ11基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

扩增编码上述GsJ11蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明发现了一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsJ11。本发明的实验证明，将GsJ11基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥对碳酸盐胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育具有碳酸盐胁迫耐性的转基因植物的研究奠定基础。

附图说明

图1为GsJ11基因在野生大豆中的组织定位分析。

图2为GsJ11基因在碳酸盐胁迫下的表达模式分析。

图3为转GsJ11拟南芥及拟南芥突变体纯合株系atj11的PCR鉴定。图3a为T₁代转GsJ11拟南芥的PCR鉴定结果，其中，M为DL 2K Marker，+为阳性对照，-为阴性对照，WT为野生型拟南芥样本，1-10为T₁代转GsJ11拟南芥样本；图3b和图3c为拟南芥突变体纯合株系atj11的三引物法PCR鉴定结果，其中，M为DL 2K Marker，WT为野生型拟南芥样本，-为阴性对照，1-12为拟南芥突变体纯合株系atj11样本。

图4为转GsJ11拟南芥及拟南芥突变体纯合株系atj11的RT-PCR鉴定。图4a为转GsJ11拟南芥的RT-PCR鉴定结果；图4b为拟南芥突变体纯合株系atj11的RT-PCR鉴定结果。

图5为转GsJ11拟南芥萌发期的耐碳酸盐胁迫分析。其中，图5a为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的萌发期表型；图5b为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的萌发率测定，其中，纵坐标代表萌发率，横坐标代表NaHCO₃处理天数。

图6为转GsJ11拟南芥幼苗期的耐碳酸盐胁迫分析。图6a为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的幼苗期表型；图6b为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的野生型拟南芥与拟南芥突变体纯合株系atj11的根长测定，其中，纵坐标代表根长，横坐标代表NaHCO₃浓度；图6c为不同浓度的碳酸盐胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)与野生型拟南芥的根长测定，其中，纵坐标代表根长，横坐标代表NaHCO₃浓度。

图7为转GsJ11拟南芥成苗期的耐碳酸盐胁迫分析。其中，图7a为150mM的NaHCO₃胁迫处理前后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的成苗期表型；图7b为150mM的NaHCO₃胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的叶绿素含量测定，其中，纵坐标代表叶绿素含量，横坐标代表对拟南芥成苗的不同处理；图7c为150mM的NaHCO₃胁迫处理后的T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)、OE3(#3)、野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11的丙二醛含量测定，其中，纵坐标代表丙二醛含量，横坐标代表对拟南芥成苗的不同处理。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的野生大豆G07256种子在文献“Yang Yu,Ailin Liu,Xiangbo Duan,Sunting Wang,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Dan Zhu,Chao Chen,Lei Cao,Jialei Xiao,Qiang Li,Zaib_un Nisa,Yanming Zhu,Xiaodong Ding.GsERF6,an ethylene-responsive factor from Glycine soja,mediates the regulation of plant bicarbonate tolerance in Arabidopsis.Planta 10.1007/s00425-016-2532-4”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的pCAMBIA330035Su载体在文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,Xiaodong Ding,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,a novel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salt tolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101在文献“Lee CW,et al.Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thal iana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

下述实施例中的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)在文献“Luo X,Sun X,Liu B,et al.Ectopic expression of a WRKY homolog from Glycine soja alters flowering time in Arabidopsis[J].PloS one,2013,8(8):e73295.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。

实施例1、野生大豆中耐碳酸盐相关基因GsJ11的获得

一、GsJ11基因的获得

1、总RNA的提取

选取饱满的野生大豆G07256种子，用浓H₂SO₄处理10min，无菌水冲洗3-4次，25℃暗培养2-3d催芽。待芽长到1-2cm时，将其转移至1/4Hogland营养液中，置于人工气候箱中培养。取3周龄野生大豆G07256幼苗的根，采用RNAprep pure试剂盒(TIANGEN)提取总RNA。

2、cDNA的获得

以OligodT为引物进行cDNA第一条链的合成，方法参见Invitrogen公司SuperScript^TM III Reverse Transcriptase说明书，得到野生大豆总cDNA。

3、PCR扩增

以野生大豆总cDNA为模板，采用引物GsJ11-FL-F和GsJ11-FL-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：

GsJ11-FL-F：5'-ATGATTTCTTCCGTGTCC-3'；

GsJ11-FL-R：5'-CTACCAGCACTGATCCGT-3'。

4、GsJ11基因的克隆载体构建及测序

将PCR扩增产物与pEASY-T载体连接，构建pEASY-GsJ11克隆载体。并对其进行测序。

测序结果表明：PCR扩增得到的大小为477bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将序列1所示的基因命名为GsJ11基因，自5’端第1-477位为CDS，GsJ11基因编码序列表中序列2所示的蛋白质，将序列2所示的氨基酸序列命名为GsJ11蛋白。

二、GsJ11基因在野生大豆中的组织定位分析

1、植物材料的处理

取3周龄的野生大豆幼苗的如下组织：根尖、茎、新叶、老叶、种子、种荚及花，置于-80℃保存。

2、cDNA的获得

取上述野生大豆不同组织样品各约100mg，液氮研磨，用RNAprep Plant Kit(TIANGEN,cat no:DP432)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。采用反转录试剂盒SuperScript^TM III Reverse Transcriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反转录获得cDNA。

3、通过Real-time PCR对GsJ11基因进行组织等位检测

以上述步骤2获得的cDNA为模板，采用引物GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R进行Real-time PCR，对GsJ11基因进行表达量检测。引物序列如下所示：

GsJ11-RT-F：5’-CGCGTACTCTACTCTTTCTGATCC-3’；

GsJ11-RT-R：5’-AGCACTGATCCGTTTCCCAG-3’。

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GAPDH基因为内参基因。目的基因在不同组织中的表达量差异通过GsJ11基因在各个组织中的表达量相对于在根尖组织中的表达量的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；

GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。

目的基因的组织定位结果如图1所示：GsJ11基因广泛表达于野生大豆的各个组织，且在新叶和花中的表达量最高。

三、GsJ11基因在碳酸盐胁迫条件下的表达模式分析

1、植物材料的处理

取3周龄的野生大豆幼苗，置于50mM NaHCO₃(碳酸盐胁迫)条件下处理，分别取处理0h、1h、3h、6h和12h的根尖组织，置于-80℃保存。

2、cDNA的获得

取经上述处理不同时间后的野生大豆根尖组织各约100mg，液氮研磨，用RNAprep Plant Kit(TIANGEN,cat no:DP432)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。采用反转录试剂盒SuperScript^TM III Reverse Transcriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反转录获得cDNA。

3、通过Real-time PCR对GsJ11基因进行表达量检测

以上述步骤2获得的cDNA为模板，采用引物GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R进行Real-time PCR，对GsJ11基因进行表达量检测。引物序列如下所示：

GsJ11-RT-F：5’-CGCGTACTCTACTCTTTCTGATCC-3’；

GsJ11-RT-R：5’-AGCACTGATCCGTTTCCCAG-3’。

Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GAPDH基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2^-ΔΔCT＝2^{-(ΔCT处理-ΔCT对照)}＝2^{-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]}。内参基因引物序列如下所示：

GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；

GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。

定量Real-time PCR结果如图2所示：碳酸盐胁迫处理后，GsJ11基因表达量呈上升趋势，并在碳酸盐胁迫处理3h后达到顶峰，表明GsJ11基因的表达受碳酸盐胁迫诱导。

实施例2、转GsJ11拟南芥植株的获得及耐盐碱性分析

一、转GsJ11拟南芥植株的获得

1、以pEASY-GsJ11克隆载体为模板，采用基因特异引物GsJ11-U-F和GsJ11-U-R进行PCR扩增，得到GsJ11基因全长CDS区。引物序列如下(下划线代表载体构建时所需的接头序列，其中U为USER酶切位点)：

GsJ11-U-F:5’-GGCTTAAUATGATTTCTTCCGTGTCC-3’；

GsJ11-U-R:5’-GGTTTAAUCTACCAGCACTGATCCGT-3’。

2、用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、USER酶(NEB,M5505S)和步骤1获得的GsJ11基因在37℃下孵育20min，利用USER酶对GsJ11基因片段的尿嘧啶处进行切割，形成可与pCAMBIA330035Su载体互补的粘性末端，接着25℃下孵育20min，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重组表达载体记作pCAMBIA330035Su-GsJ11，并送交测序。

测序结果表明：pCAMBIA330035Su-GsJ11为在pCAMBIA330035Su载体中插入如序列表中序列1所示的GsJ11基因后，且保持pCAMBIA330035Su载体的其他序列不变得到的载体。pCAMBIA330035Su-GsJ11表达序列表中序列2所示的蛋白质。

3、采用冻融法，将pCAMBIA330035Su-GsJ11载体转化至根癌农杆菌GV3101，获得重组农杆菌，并经PCR鉴定得到阳性转化子(含有序列表中序列1所示的GsJ11转化子)，用于侵染拟南芥植株。

4、转GsJ11拟南芥的获得及鉴定

将上述重组农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。将T₀代种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选。将T₁代抗性苗移栽至营养钵中培养，提取基因组DNA，进行PCR和RT-PCR鉴定。具体步骤如下：

采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit基因组提取试剂盒(全式金，EE111-01)，提取野生型和固杀草抗性植株的基因组DNA，用基因特异引物(GsJ11-FL-S和GsJ11-FL-AS)进行PCR鉴定(图3a)。对PCR鉴定阳性的植株，提取总RNA，采用半定量RT-PCR，以拟南芥ACTIN2基因为内参，利用实施例1中的Real-time PCR引物(GsJ11-RT-F和GsJ11-RT-R)检测GsJ11基因在转基因植株中的表达量(图4a)。ACTIN2基因特异引物序列如下：

ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；

ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。

将RT-PCR阳性的T₁代转GsJ11拟南芥单株收种子，并分别播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选，观察T₂代分离情况。如此重复，直至得到T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系。选取T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)和OE3(#3)用于下述耐碳酸盐分析。

二、拟南芥纯合突变体atj11植株的获得和鉴定

在拟南芥信息资源中心(The Arabidopsis Information Resource center)中购买拟南芥AtJ11基因T-DNA插入的突变体种子atj11(SALK_015630C)。并采用三引物法对拟南芥突变体atj11植株进行PCR，鉴定该突变体株系是否纯合。引物序列如下：

atj11-LB：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’；

atj11-LP：5’-TTATGGCTGCATCCCTAATTG-3’；

atj11-RP：5’-TTCTTCTCCGCCTCTATCTCC-3’。

PCR扩增结果如图3b和图3c所示。以atj11-LB和atj11-RP为引物进行扩增时，突变体能扩增出T-DNA插入片段，但是野生型植株不能扩增出，说明T-DNA已插入到AtJ11基因内部；以atj11-LP和atj11-RP为引物进行扩增时，突变体扩增不出目的基因产物，但是野生型植株能扩增出目的基因产物，说明在该突变体中AtJ11基因已经被沉默，且该突变体为纯合体。

分别以野生型拟南芥植株和拟南芥纯合突变体atj11植株(对atj11-LP与atj11-RP引物对PCR结果阴性且atj11-LB与atj11-RP引物对PCR结果为阳性的植株)的cDNA为模板，以atj11-RT-F和atj11-RT-R为引物atj11-RT-F：5’-GAAGATCCATGCCGCTTACTG-3’和atj11-RT-R：5’-CGGAGGAAACACAGAATACCC-3’)进行半定量RT-PCR扩增结果也表明拟南芥纯合突变体atj11在转录水平上为纯合突变体(图4b)。可用于下述耐碳酸盐分析。

三、转GsJ11拟南芥耐碳酸盐分析

1、种子萌发期耐碳酸盐表型分析

选取饱满的野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的种子，用5％NaClO处理6-8min，灭菌ddH₂O冲洗6次，4℃春化3d，分别播种于正常的1/2MS培养基、含6mM NaHCO₃的1/2MS培养基、含7mM NaHCO₃的1/2MS培养基和8mM NaHCO₃的1/2MS培养基，22℃培养5d，观察记录拟南芥种子萌发状态。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。

结果如图5所示，碳酸盐胁迫严重抑制了野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系的种子萌发，但转GsJ11拟南芥纯合体株系的种子萌发速率显著高于野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11(图5a和图5b)。

2、幼苗期耐碳酸盐表型分析

选取饱满的野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的种子，用5％NaClO处理6-8min，灭菌ddH₂O冲洗6次，4℃春化3d，播种于正常的1/2MS培养基，22℃培养11d。待拟南芥长至六叶期，将幼苗分别移至正常的1/2MS培养基、含6mM NaHCO₃的1/2MS培养基和含7mM NaHCO₃的1/2MS培养基竖直培养7d。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。

结果如图6a至图6c所示。当不存在NaHCO₃胁迫时，野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系的根长无显著差异；当NaHCO₃的浓度为6mM时，T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根长分别为4.48cm、4.51cm和4.35cm；野生型拟南芥的根长为3.61cm(图6c)；而在同样条件下，拟南芥突变体纯合株系atj11的根长为2.03cm；野生型拟南芥的根长为3.36cm(图6b)。当NaHCO₃的浓度为7mM时，T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根长分别为3.62cm、3.88cm和4.16cm；野生型拟南芥的根长为2.90cm(图6c)；而在同样条件下，拟南芥突变体纯合株系atj11的根长为1.64cm；野生型拟南芥的根长为2.80cm(图6b)。从图中和以上结果可以看出：碳酸盐胁迫抑制了野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根的伸长(图6a)，但T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的根长要长于野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11(图6b和图6c)。

3、成苗期耐碳酸盐表型分析

选取饱满的野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的种子，春化后播种于营养钵中(营养土：君子兰土：蛭石1：1：1)，置于人工气候培养箱中培养。选取长势一致的4周龄拟南芥植株，每3d浇灌1次150mM NaHCO₃(pH 9.0)溶液进行盐碱胁迫处理，观察胁迫处理后植株表型。

结果如图7a所示：碳酸盐胁迫处理后野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11及T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)都逐渐失绿甚至死亡，但是T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系OE1(#1)、OE2(#2)及OE3(#3)的长势明显优于野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11。

上述结果表明GsJ11基因超量表达显著提高了植物的碳酸盐胁迫耐性。

4、耐碳酸盐生理指标分析

1)叶绿素含量分析

选取步骤3中用于成苗期表型分析的野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系，待表型明显后，取待测叶片放入EP管，称重。用组织破碎仪震荡成粉末，加入1mL预冷的80％丙酮，混匀，避光抽提15min；10000×g离心8min，取上清200μL并加入400μL的80％丙酮，混匀。用紫外分光光度计测在645nm和663nm处的吸光度，用80％丙酮调零，并计算叶绿素含量。

结果如图7b所示，在碳酸氢钠胁迫处理下，野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系的叶绿素含量均有所下降，但转GsJ11拟南芥纯合体株系的叶绿素含量明显高于野生型，而野生型拟南芥的叶绿素含量则明显高于拟南芥突变体纯合株系atj11，说明GsJ11基因超量表达提高了拟南芥的耐碳酸盐能力。

2)丙二醛含量分析

选取步骤3中用于成苗期表型分析的野生型拟南芥、拟南芥突变体纯合株系atj11和T₃代转GsJ11拟南芥纯合体株系，待表型明显后，取待测叶片放入EP管，称重。用组织破碎仪震荡成粉末，加1mL 5％的三氯乙酸(TCA)，5000×g离心10min。取上清液400μL，加入400μL 0.5％的硫代巴比妥酸溶液(TBA)，摇匀，沸水浴20min(自管中出现小气泡时开始计时)。将EP管取出，冷却后，5000×g离心10min。用紫外分光光度计测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度，并计算丙二醛含量(用等体积5％的三氯乙酸和0.5％的硫代巴比妥酸的混合液调零)。

结果如图7c所示，在碳酸氢钠胁迫处理下，转GsJ11拟南芥纯合体株系的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥和拟南芥突变体纯合株系atj11，说明GsJ11基因的超量表达可以提高拟南芥的耐碳酸盐能力。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种与植物碳酸盐胁迫耐性相关蛋白GsJ11及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>477bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgatttctt ccgtgtcctt tccagcgtct cttcccgccg ttaacttctc cggcaacgcc 60

gtggcttctc cgtcgtgccg cgtcaaatcc aggcctatag ttgccttcgc caccgccacc 120

gccaccgcgg aagctcgctc ttcctggacg gagcaaccga gaccttcgta tctgaactcc 180

tcttgctctt cgctctacga ggttctcggc atccccgccg gcgcctctaa ccaagaaatc 240

aaggcggcgt accggcgact ggccagagtc ttccaccccg acgtggcggc gattgaccgg 300

aaaaactcat ccgccgatga gttcatgaag atccacgctg cgtactctac tctctcggat 360

cccgacaagc gcgccaacta cgatcagagg ctcttccggc gacaacggcc gttgtcgacg 420

gcggcggtgt tctccggtta tacgcgtcgg aactgggaaa cggatcagtg ctggtag 477

<210>2

<211>158

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Ile Ser Ser Val Ser Phe Pro Ala Ser Leu Pro Ala Val Asn Phe

1 5 10 15

Ser Gly Asn Ala Val Ala Ser Pro Ser Cys Arg Val Lys Ser Arg Pro

20 25 30

Ile Val Ala Phe Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Glu Ala Arg Ser Ser

35 40 45

Trp Thr Glu Gln Pro Arg Pro Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Cys Ser Ser

50 55 60

Leu Tyr Glu Val Leu Gly Ile Pro Ala Gly Ala Ser Asn Gln Glu Ile

65 70 75 80

Lys Ala Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Arg Val Phe His Pro Asp Val Ala

85 90 95

Ala Ile Asp Arg Lys Asn Ser Ser Ala Asp Glu Phe Met Lys Ile His

100 105 110

Ala Ala Tyr Ser Thr Leu Ser Asp Pro Asp Lys Arg Ala Asn Tyr Asp

115 120 125

Gln Arg Leu Phe Arg Arg Gln Arg Pro Leu Ser Thr Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Arg Arg Asn Trp Glu Thr Asp Gln Cys Trp

145 150 155