本发明涉及蛋白的保存方法及用于该保存方法的试剂。
背景技术：
：近年来开发了利用酶反应的高特异性的各种检查方法或诊断方法，其一部分作为制品在社会中普及。一般来说，酶反应由于是由缓冲液或金属盐、基质、辅酶等构成的复杂组成，因此在检查或诊断时对反应溶液进行用时制备是复杂的操作。因而，为了简化反应溶液的制备，有预先将反应所需的试剂类进行混合的方法。液状形态的预混试剂可以仅添加检体进行使用、简便性高。但是，酶在稀释溶液的状态下长期保存时，多有发生失活的情况，在低温下的保质期为1年左右。另一方面，干燥形态的预混试剂虽然在使用时需要进行溶解，但由于可以任意地选择溶解液的种类、分量，因而用途扩展的范围较广。另外，轻量、易于运输，在常温下能够长期地稳定地保存。酶反应中充分已知的反应之一是利用聚合酶进行序列特异性的核酸合成反应。以pcr为代表的核酸扩增法利用该反应，不仅限于学术研究的情况，在基因检查等中也被充分使用。基因检查试剂中，有仅通过添加检体、反应即可开始者，为干燥试剂时，还存在可在室温下长期稳定地保存者。在核酸扩增反应中，为了使反应最佳化，含有铵盐者并不少。例如，作为等温扩增法的lamp法或smartamp法中使用的bstdna聚合酶或aacdna聚合酶等一般来说在反应溶液中含有硫酸铵(非专利文献1、2)。但是，很早就已知当对这种含有铵盐的试剂进行冷冻干燥时，即便是刚干燥后，再溶解的反应溶液的酶活性也会显著降低。对于该问题，提出了以不使酶和缓冲剂或其成分与铵盐进行接触、或者不以高浓度使它们接触的状态进行冷冻干燥，在反应时进行混合的方法(专利文献1)。但是，由于有制品形态受到限制的可能，因而还没有在反应前不需预先进行分离的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2006-129727号公报非专利文献非专利文献1：notomiet.al.，nucleicacidsres.，28，2000，e63非专利文献2：mitaniet.al.，nat.methods，4，2007，257-262技术实现要素：发明所要解决的课题本发明的课题在于解决上述现有技术的问题，提供在反应时不需要在体系中补充成分，在室温下也可稳定地保存的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。用于解决课题的手段本发明者们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现，通过使用good’s缓冲剂，可以抑制对含铵盐的试剂进行干燥、进行再溶解时所发生的酶活性的降低，进而发明了本方法及本试剂。即，本发明包含以下构成。(1)good’s缓冲剂在用于抑制至少由缓冲剂、铵盐及酶构成的生化学反应试剂在干燥时的酶活性降低的用途。(2)一种干燥试剂组合物的制造方法，其包含以下工序：a)含有超过2.5mm浓度的good’s缓冲剂、铵盐、干燥保护剂及核酸扩增酶的试剂溶液的制备工序；b)a)中制备的试剂溶液的干燥工序。(3)上述(2)所述的制造方法，其特征在于，所述good’s缓冲剂的浓度为5mm以上。(4)上述(2)或(3)所述的制造方法，其中，所述good’s缓冲剂为bes、bicine、ches、dipso、epps、hepes、heppso、mops、popso、taps、tapso、tes及tricine中的至少1个。(5)上述(2)～(4)中任一项所述的制造方法，其中，所述good’s缓冲剂为bes、bicine、hepes、heppso、popso及tricine中的至少1个。(6)上述(2)～(5)中任一项所述的制造方法，其中，所述good’s缓冲剂为bicine或tricine。(7)上述(2)～(6)中任一项所述的制造方法，其中，所述铵盐为硫酸铵。(8)上述(2)～(7)中任一项所述的制造方法，其中，所述干燥保护剂为糖类、表面活性剂、水溶性聚合物、蛋白中的至少1个。(9)一种核酸扩增反应用干燥试剂组合物，其是通过上述(2)～(8)中任一项所述的制造方法获得的。本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请号2015-095535号的公开内容。发明效果通过本发明，可以提供在反应时不需要在体系中补充成分，在室温下也可稳定地保存的干燥形态的含铵盐的酶反应试剂。具体实施方式本发明中的good’s缓冲剂在缓冲剂中特别是指含有分子内具有两性离子结构的化合物的缓冲剂，作为其特征性性质，可举出化学稳定、酸解离平衡(aciddissociationequilibrium)难以受到离子组成的影响或者与金属离子的络合物形成能力小等，但只要是显示与它们同样性质的物质，则无限定。本发明中的good’s缓冲剂优选为bes(n,n-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(n,n-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonicacid))、bicine(n,n-二(2-羟乙基)甘氨酸(n,n-bis(2-hydroxyethyl)glycine))、ches(n-环己基-2-氨基乙磺酸(n-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonicacid))、dipso(3-[n,n-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸((3-[n,n-bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxy-1-propanesulfonicacid))、epps(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid))、hepes(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid))、heppso(2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid))、mops(3-吗啉代丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonicacid))、popso(哌嗪-1,4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(piperazine-1，4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonicacid))、taps(n-三(羟甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(n-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonicacid))、tapso(2-羟基-n-三(羟甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(2-hydroxy-n-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonicacid))、tes(n-三(羟甲基)甲基-2-胺基-乙磺酸(n-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicacid))及tricine(n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸)n-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine))中的至少1个，更优选为bes、bicine、hepes、heppso、popso及tricine中的至少1个，进一步优选为bicine及tricine。本发明中，good’s缓冲剂可以使用水合物、盐等各种形态者。例如，作为heppso可以使用2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid)一水合物，作为popso可以使用哌嗪-1,4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(piperazine-1，4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonicacid)二水合物。本发明中使用的good’s缓冲剂的浓度优选按照成为超过2.5mm的值的方式进行设定。更优选可设定为5mm以上。如此，可以获得足以维持酶活性的缓冲效果。另一方面，该值低于2.5mm时，有无法获得足以维持酶活性的缓冲效果的可能性。此时，为了使酶活性恢复，需要在反应前追加试剂，但例如在核酸扩增反应中，这种试剂追加的工序有增大污染风险的危险性。而且，工序追加会导致制造成本的增加。另外，本发明中使用的good’s缓冲剂的浓度优选设定为125mm以下。超过125mm时，有酶反应受到阻碍的可能性。本发明中使用的good’s缓冲剂的ph根据所用酶的种类的不同而多种多样，只要是在上述各缓冲剂的缓冲域范围内，则无特别限定，优选ph为7.0以上、更优选ph为7.5以上、进一步优选ph为8.0以上，且优选ph为10.0以下、更优选ph为9.5以下、进一步优选ph为9.0以下，具体地优选ph为7.0～10.0、更优选ph为7.5～9.5、最优选ph为8.0～9.0。本发明中使用的铵盐优选是苯甲酸铵、氯化铵、甲酸铵、柠檬酸三铵、柠檬酸氢二铵、柠檬酸二氢铵、醋酸铵、溴化铵、酒石酸铵、硝酸铵、草酸铵、硫氰酸铵、硫酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵等，更优选硫酸铵。本发明中使用的铵盐的浓度并无特别限定，优选为1mm以上、更优选为2mm以上、进一步优选为5mm以上，且优选为50mm以下、更优选为40mm以下、进一步优选为25mm以下，具体地优选为1～50mm、更优选为2～40mm、最优选为5～25mm。为该数值范围外时，有无法充分获得提高酶活性的效果的可能性。本发明中使用的酶只要是由于铵盐的存在而在干燥时有酶活性降低的顾虑的酶，则无特别限定。例如，在pcr或等温扩增法等核酸扩增反应中使用的核酸扩增酶也是其中一种。具体地说，aacdna聚合酶、bstdna聚合酶、pfudna聚合酶、t4dna聚合酶、taqdna聚合酶、tf1dna聚合酶、tthdna聚合酶等dna聚合酶为其中一例。其中，这些核酸扩增酶还可以具有逆转录功能。本发明中使用的酶的浓度只要目标反应进行，则无特别限定，例如在核酸扩增反应中优选为0.01u以上或100u以下、更优选为0.1u以上或50u以下、最优选为1u以上或10u以下。本发明中的生化学反应试剂未干燥状态下的good’s缓冲剂的浓度、good’s缓冲剂的ph、铵盐的浓度、酶的浓度优选分别从上述范围内进行选择。同样，通过本发明的试剂溶液的制备工序制备的试剂溶液中的good’s缓冲剂的浓度、good’s缓冲剂的ph、铵盐的浓度、酶的浓度优选分别从上述范围内进行选择。本发明的生化学反应试剂优选是进行利用聚合酶的核酸扩增反应、利用连接酶的连接反应、抗体抗原反应、利用激酶的磷酸化反应、利用烷基转移酶的烷基化反应、利用核酸酶的核酸分解反应、dna同源重组反应、利用蛋白酶的蛋白分解反应的试剂，更优选是进行利用聚合酶的核酸扩增反应的试剂。本发明中的试剂溶液的制备工序是指使good’s缓冲剂、铵盐、干燥保护剂及核酸扩增酶等溶解在溶剂中的工序。作为溶剂，优选水，作为水，优选蒸馏水或去离子水、更优选灭菌蒸馏水、灭菌去离子水。其中，本工序一般是在低温下进行的，但也可调整工序的温度，也可以将进行工序的室内等空间调整至低温。本发明中的干燥工序优选通过真空干燥、冷冻干燥、热风干燥或喷雾干燥等手段进行，更优选的手段是冷冻干燥。冷冻干燥只要使用一般的冷冻干燥装置即可，其条件可以在一般的范围内适当地确定。另外，还可根据需要进行预备冷冻。本发明的酶活性降低是指干燥后溶解的溶液中的酶活性比干燥前溶液中的酶活性更低。作为其原因之一，认为是将含有作为通常缓冲剂的tris-hcl缓冲剂和铵盐的试剂经过干燥后、进行再溶解时，反应溶液的ph偏离酶的最佳ph大幅地发生变化，但原因并无特别限定。另外，酶活性的测定方法根据各个酶不同而多种多样，需要适当地选择与该酶相配的测定方法。例如，在核酸扩增反应中，可以使用作为pcr的扩增产物达到一定量时的循环数ct值(thresholdcycle，循环阈值)、作为等温扩增反应的扩增产物达到一定量时的时间tt值(thresholdtime，阈值时间)。这些值可以通过使用sybrgreen等荧光性核酸嵌入剂或taqman探针等荧光性核酸探针，实时地监测扩增产物来获得。本发明中的干燥组合物需要通过上述干燥方法将水分自生化学反应试剂中除去，在进行目标反应时进行水分的添加。此时的水分包含纯水、缓冲液、盐溶液、蛋白溶液、有机溶剂。本发明的干燥组合物为了更强地保持酶活性，优选含有干燥保护剂。作为这里所使用的干燥保护剂，可举出糖类、表面活性剂、水溶性聚合物、蛋白。作为糖类，可以使用单糖类、二糖类、三糖类、低级寡聚糖类、多糖类以及它们的衍生物。具体地说，可举出作为单糖类的阿拉伯糖、葡萄糖、作为单糖类衍生物的山梨糖醇、甘露醇，作为还原二糖类的纤维素二糖、麦芽糖、乳糖，作为非还原二糖类的蔗糖、海藻糖，作为三糖类的棉子糖、麦芽三糖，作为低级寡聚糖类的麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖，作为多糖类的葡聚糖。更优选可举出阿拉伯糖、蔗糖、纤维素二糖、葡聚糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽三糖、乳糖、棉子糖等。作为表面活性剂，优选np-40(nonidetp-40、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇)、tween20(聚山梨酸酯20、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、tritonx-100(聚(氧乙烯)辛基苯基醚)，作为水溶性聚合物，优选聚蔗糖(ficoll)、聚乙二醇，作为蛋白，优选牛血清白蛋白等。干燥保护剂可以以任意的比例对任意种类的物质进行混合，并不限定于实施例的范围。干燥保护剂的添加量在干燥组合物中优选为1(w/v)％以上、更优选为2.5(w/v)％以上、且优选为30(w/v)％以下、更优选为20(w/v)％以下，具体地优选为1～30(w/v)％、更优选为2.5～20(w/v)％。为该数值范围以下时，有无法获得充分的酶活性维持的效果，相反为该数值范围以上时，有阻碍酶活性的可能性。实施例以下示出实施例具体地说明本发明。但本发明并不限定于实施例。需要说明的是，未特别注明时，试剂使用从和光纯药株式会社购买的试剂。(实施例1)制备在1ml的去离子水中含有20mmgood’s缓冲剂、10mm氯化钾、10mm硫酸铵(nacalaitesque株式会社制)、8mm硫酸镁(关东化学株式会社制)、1.4mm脱氧核糖核酸(株式会社nippongene制)、5％海藻糖(nacalaitesque株式会社制)的溶液。作为good’s缓冲剂，使用利用naoh将ph调整至8.0的bes、bicine、dipso(sigma-aldrich制)、epps、hepes(gibcolaboratories制)、heppso、mops、popso、taps、tapso(sigma-aldrich制)、tes(nacalaitesque株式会社制)、tricine(nacalaitesque株式会社制)及ph调整至8.8的ches。在－40℃下对该溶液预备冷冻1小时后，减压至10pa以下，在－40℃下用7小时、－10℃下用12小时、10℃下用3小时、25℃下用1小时，使用冷冻干燥机(fdu-2110型及drc-1000型、东京理科器械株式会社制)进行冷冻干燥。干燥后，利用去离子水对各个干燥试剂进行溶解，利用ph测量仪测定ph之后，与干燥前的值进行比较。再溶解时的去离子水的量为1ml。将结果示于表1中。ph变化值表示干燥后的ph值减去干燥前的ph之差。表1代替good’s缓冲剂，使用利用hcl将ph调整至8.0或将ph调节至8.8的tris缓冲剂(nacalaitesque株式会社制)，在与实施例1相同的条件下制作冷冻干燥试剂。利用去离子水将这些干燥试剂溶解，利用ph测量仪测定ph之后，与干燥前的值进行比较。将结果示于表1。由表1可知，使用good’s缓冲剂时，与使用tris缓冲剂的情况相比，可见明显的ph变化抑制。(实施例2)制备在25μl的去离子水中含有20mmgood’s缓冲剂、10mm氯化钾、10mm硫酸铵(nacalaitesque株式会社制)、8mm硫酸镁(关东化学株式会社制)、1.4mm脱氧核糖核酸(株式会社nippongene制)、1.6μm引物1(序列号1)、1.6μm引物2(序列号2)、0.8μm引物3(序列号3)、0.2μm引物4(序列号4)、0.2μm引物5(序列号5)、4ubstdna聚合酶(株式会社nippongene制)、5％海藻糖(nacalaitesque株式会社制)的溶液。作为good’s缓冲剂，使用利用naoh将ph调整至8.0的bicine、hepes(gibcolaboratories制)、heppso、popso、taps、tapso(sigma-aldrich制)、tes(nacalaitesque株式会社制)、tricine(nacalaitesque株式会社制)及ph调整至8.8的ches。在－40℃下对该溶液预备冷冻1小时后，减压至10pa以下，在－40℃下用7小时、－10℃下用12小时、10℃下用3小时、25℃下用1小时，使用冷冻干燥机(fdu-2110型及drc-1000型、东京理科器械株式会社制)进行冷冻干燥。干燥后，利用去离子水对各个干燥试剂进行溶解，添加模板(1ng)，在63℃下孵育60分钟。再溶解时的去离子水的量为25μl。使用实时荧光测定(lightcycler96、roche制)进行反应的追踪，使用lightcyclersoftware计算作为反应速度尺度的tt值。将该tt值与干燥前的值相比较。将结果示于表2中。tt变化值表示各个good’s缓冲材料的干燥后的tt值减去干燥前的tt值之差。表2代替good’s缓冲剂，使用利用hcl将ph调整至8.0或将ph调整至8.8的tris缓冲剂(nacalaitesque株式会社制)，在与实施例2相同的条件下制作冷冻干燥试剂。利用去离子水将这些干燥试剂溶解，添加模板(1ng)，在63℃下孵育60分钟。使用实时荧光测定(lightcycler96、roche制)进行反应的追踪，使用lightcyclersoftware计算作为反应速度尺度的tt值。将该tt值与干燥前的值相比较。将结果示于表2中。由表2可知，使用good’s缓冲剂时，与使用tris缓冲剂的情况相比，明显地抑制了tt值的变化。(实施例3)制备在25μl的去离子水中含有5～40mmtricine-naoh(ph为8.0、浓度记载于表中)、10mm氯化钾、10mm硫酸铵(nacalaitesque株式会社制)、8mm硫酸镁(关东化学株式会社制)、1.4mm脱氧核糖核酸(株式会社nippongene制)、1.6μm引物1(序列号1)、1.6μm引物2(序列号2)、0.8μm引物3(序列号3)、0.2μm引物4(序列号4)、0.2μm引物5(序列号5)、4ubstdna聚合酶(株式会社nippongene制)、5％海藻糖(nacalaitesque株式会社制)的溶液。在－40℃下对该溶液预备冷冻1小时后，减压至10pa以下，在－40℃下用7小时、－10℃下用12小时、10℃下用3小时、25℃下用1小时，使用冷冻干燥机(fdu-2110型及drc-1000型、东京理科器械株式会社制)进行冷冻干燥。干燥后，利用去离子水对各个干燥试剂进行溶解，添加模板(1ng)，在63℃下孵育60分钟。再溶解时的去离子水的量为25μl。使用实时荧光测定(lightcycler96、roche制)进行反应的追踪，使用lightcyclersoftware计算作为反应速度尺度的tt值。将该tt值与干燥前的值相比较。将结果示于表3中。tt变化值与实施例2同样地计算。表340mm20mm10mm5mm2.5mm1mmtt变化值3.925.115.378.3420以上20以上(比较例3)利用2.5mm或1mm的tricine-naoh，在与实施例3相同的条件下制作冷冻干燥试剂。利用去离子水对各个干燥试剂进行溶解，添加模板(1ng)，在63℃下孵育60分钟。使用实时荧光测定(lightcycler96、roche制)进行反应的追踪，使用lightcyclersoftware计算作为反应速度尺度的tt值。将该tt值与干燥前的值相比较。将结果示于表3中。由表3可知，在超过2.5mm的浓度时，本发明可以维持酶活性。本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请均直接通过引用纳入到本说明书中。序列表<110>株式会社钟化<120>干燥形态的酶反应试剂及其制备方法<130>b150133<150>jp2015-095535<151>2015-05-08<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>36<212>dna<213>artificial<220><223>primer1<400>1cttatataattataaggaatgcaatcaggtcgtttc36<210>2<211>35<212>dna<213>artificial<220><223>primer2<400>2cccgaaaatgagacaccgatttaatcgcaacacgc35<210>3<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>primer3<400>3agatatagcatacccagggtc21<210>4<211>13<212>dna<213>artificial<220><223>primer4<400>4aaaccgtcctgcc13<210>5<211>13<212>dna<213>artificial<220><223>primer5<400>5gttcgcgccagtg13当前第1页12