新型蛋白质及检测方法与流程

引言

本发明涉及新型温带臭虫蛋白质以及在环境中(诸如家庭环境或商业环境)检测臭虫存在的方法。

臭虫是红棕色、无翅、专性噬血，需要血餐来羽化。它们在外形上呈扁平、椭圆和细长的，长度近似5-7mm且具有3对足。臭虫是靠人类和其他温血宿主的血液生存的昆虫。臭虫会被热量、有气味的臭虫排泄物和温血哺乳类动物、鸟类以及它们自己排出的二氧化碳所吸引。睡眠区域、床垫、弹簧床垫、床头柜、床头是臭虫隐藏的理想环境。臭虫最可能在白天隐藏在黑暗封闭的位置并且偏爱织物、木头和粗砂质磨砂纸类表面的裂缝和裂隙。它们通常被发现隐藏在床和家具的裂隙和裂缝中。

臭虫以血液为食，在夜间活动并叮咬裸露皮肤的任何区域。由于臭虫的叮咬可出现若干不利于健康的影响，包括皮疹、过敏反应和/或精神损害。

近些年，在欧洲、澳洲和北美洲的臭虫感染的发病率急剧增加。这部分由于全球旅行和移民的增加。其他解释包括对害虫防治管理的杀虫剂抗性/改变的增加以及二手家具的使用。臭虫虫口的增长带来了臭虫叮咬和相关病症的增加。

臭虫的扩散导致感染通过两种传播形式发生：1-主动传播，其需要臭虫通过它们自己的方式(诸如爬行)穿过通风管、墙壁上的洞并且还有管道从房间至房间迁移。主动传播可能由于杀虫剂的散布、两性间的冲突或宿主刺激，以及2-被动传播或人类运输，其中臭虫在衣服上或行李箱和家具中被携带到新地点，鸟类和蝙蝠也适于臭虫的被动传播。

臭虫在到达成年前经过5龄期阶段。在此过程期间的每个阶段，需要血餐来引发用于发展到下一个阶段的蜕皮。雌臭虫在其一生中可产200-500个卵。

专与人类互动的臭虫有两个主要物种

1.温带臭虫(普通臭虫)

2.热带臭虫(发现于热带区域)

该两个物种温带臭虫和热带臭虫似乎在混合种群中茁壮成长，且在澳大利亚和英国甚至发现热带臭虫的流行的增加，表明虽然各物种仍然具有明确的生态龛，但界限变得模糊不清。

现今，在分子水平上关于臭虫信息有限，因为直到最近只进行了转录组学。转录组学是研究在特定时间存在于各种细胞或组织类型的转录rna。这些表达的rna然后被制成用于分子分析的cdna文库。这些研究导致了来自三种不同臭虫品系(里士满-杀虫剂抗性、哈伦-杀虫剂敏感以及来自俄亥俄公寓的暴露于杀虫剂的品系的大量完整的和部分完整的mrna序列读取(reads)。

实际需要提供快速且容易检测臭虫存在的方式。

技术实现要素：

根据本发明，提供了包含选自seqidno.1或seqidno.5或其片段中的任意一种的氨基酸序列的来自温带臭虫(cimexlectularius)的分离蛋白质或包含选自seqidno.2、seqidno.3、seqidno.6和seqidno.7或其片段中的任意一种或多种的氨基酸序列的来自温带臭虫的分离多肽，所述分离蛋白质和所述分离多肽用于产生抗体来检测温带臭虫特异性抗原的存在，其中所述抗体能够检测从卵、若虫、蜕皮至成熟的雌性和雄性成虫的温带臭虫发育的所有阶段中的抗原浓度低于20μg/ml的温带臭虫抗原。

本发明的一种实施方式提供了，该重组截短多肽包含选自seqidno.4或seqidno.8或其片段中的任意一种的氨基酸序列的来自温带臭虫蛋白质的重组截短多肽，所述重组截短多肽用于产生抗体来检测温带臭虫特异性抗原的存在，其中抗体对从卵到成熟成虫的温带臭虫发育的所有阶段中的且在抗原浓度低于20μg/ml的温带臭虫抗原是特异性的。

在本发明的一种实施方式中，所产生的抗体是单克隆抗体。

在本发明的一种实施方式中，抗体能够检测浓度低于10μg/ml温带臭虫抗原。

在本发明的另一种实施方式中，所产生的抗体能够检测温带臭虫和热带臭虫(cimexhemipterus)二者特异性的抗原。

在本发明的一种实施方式中，来自温带臭虫的分离蛋白质是不溶性蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，来自温带臭虫的分离蛋白质或分离多肽用于过敏原检测。

根据本发明，提供了用于检测样品中温带臭虫或热带臭虫的方法，包括以下步骤；

将样品与单克隆抗体接触来形成单克隆抗体-多肽复合物；以及将所述单克隆抗体-多肽复合物与另一种与复合物结合的被报告试剂标记的单克隆抗体接触，从而检测样品中温带臭虫或热带臭虫的存在。

优选地样品包括在从卵、若虫、蜕皮或成虫的雌臭虫或雄臭虫发育的任何阶段的温带臭虫或热带臭虫。最优选地单克隆抗体对于从卵、若虫、蜕皮至成熟雌性和雄性成虫的温带臭虫发育的所有阶段中的温带臭虫抗原是特异性的。

根据本发明，还提供了用于检测样品中温带臭虫或热带臭虫的方法，包括；

侧流膜；

用于接收测试样品的位于侧流膜第一下部末端的第一区域，其中第一区域包含对于温带臭虫或热带臭虫特异性的单克隆抗体，该抗体被报告试剂标记；

包含固定化对照多肽的位于侧流膜第二上部末端的第二区域；以及

位于第一区域和第二区域之间的第三区域，其中第三区域包含对于温带臭虫或热带臭虫特异性的固定化单克隆抗体。

优选的单克隆抗体以低于10mg/ml的浓度存在。更优选地单克隆抗体以低于5mg/ml的浓度存在。

在本发明的一种实施方式中，可检测的标记试剂选自胶乳抗体偶联物或金抗体偶联物中的任意一种或多种。

在本发明的另一种实施方式中，单克隆抗体被hrp或生物素中的任意一种或多种标记。

根据本发明，提供了用于检测样品中温带臭虫或热带臭虫的存在的诊断试剂盒，包括：

至少一个固体表面，其上固定着对于选自seqidno.1、2、3、4、5、6、7或8或其片段中的任意一种或多种的氨基酸序列特异性的单克隆抗体；

将样品与单克隆抗体在允许所述抗体与样品中的温带臭虫或热带臭虫抗原结合的条件下接触；以及

将与样品结合的抗体的量与对照值比较，并由此确定样品中温带臭虫或热带臭虫的存在或不存在。

根据本发明提供了包括本发明的诊断试剂盒的用于确定温带臭虫或热带臭虫的存在或不存在的快速检测方法。

本发明的一种实施方式提供了包含选自seqidno.1或seqidno.5或其片段中的任意一种的氨基酸序列的来自温带臭虫的分离蛋白质，或包含选自seqidno.2、seqidno.3、seqidno.6和seqidno.7或其片段中的任意一种或多种的氨基酸序列的来自温带臭虫的分离多肽。

本发明的一种实施方式提供了包含选自seqidno.4或seqidno.8或其片段中的任意一种的氨基酸序列的来自温带臭虫蛋白质的重组截短多肽。

附图说明

参考附图，从本发明的以下的描述中将会更清晰的理解本发明，其中：

图1是示出了从小鼠杂交瘤细胞系(由genscriptusainc生成)产生的针对臭虫卵壳蛋白表位1(esp)(seqidno.2)和表位3(seqidno.3)的六种小鼠igg单克隆抗体的表；

图2是示出了从小鼠杂交瘤细胞系(由genscriptusainc生成)产生的针对臭虫蛋白1表位1(bbp1)(seqidno.6)和表位2(seqidno.7)的四种小鼠igg单克隆抗体的表；

图3是通过hi-trapg蛋白柱(ghhealthcare)纯化的esp的单克隆抗体的亲和纯化曲线，(a)示出了单克隆抗体mabesp-1[4b9e7]并且(b)示出了mabesp-3[4d1b8和10b9f9]。用ph6.5的0.1m甘氨酸以1ml/分钟的流速洗脱该单克隆抗体。箭头指示洗脱的起点。峰值部分使用centricon装置合并和浓缩；

图4是通过hi-trapg蛋白柱(ghhealthcare)纯化的抗bbp1的单克隆抗体的亲和纯化纯化曲线，(a)示出了单克隆抗体mabbbp1-1[5d3e8]并且(b)示出了mabbbp1-2[10b1c5]。用0.1m甘氨酸(ph6.5)以1ml/分钟的流速洗脱该单克隆抗体。箭头指示洗脱的起点。峰值部分使用centricon装置合并和浓缩；

图5是在图3中g蛋白柱亲和纯化的mabesp-1单克隆抗体和mabesp-3单克隆抗体的sds-page分析。

泳道1：流穿mabesp-1，泳道2：还原的mabesp-1，泳道3：非还原的mabesp-1，泳道4：空白，泳道5：流穿mabesp-3，泳道6：还原的mabesp-3，泳道7：非还原的mabesp-3，泳道8：空白，泳道9：bsa对照(66.5kda)；

图6是在图4中g蛋白柱亲和纯化的mabbbp1-1单克隆抗体和mabbbp1-2单克隆抗体的sds-page分析。

泳道1：预染色蛋白质分子量标准，泳道2：杂交瘤培养基mabbbp1-1，泳道3：还原的mabbbp1-1，泳道4：非还原的mabbbp1-1，泳道5：空白，泳道6：杂交瘤培养基mabbbp1-2，泳道7：还原的mabbbp1-2，泳道8：非还原的mabbbp1-2，泳道9：bsa对照(66.5kda)；

图7(a)示出了在sds-page蛋白凝胶上运行的纯化的天然esp蛋白质。

图7(b)是使用兔多克隆抗体抗esp-3探测的蛋白质印迹来鉴定esp蛋白质。

图8是斑点印迹，示出了(a)mabesp-1[4b9e7]的生物素标记与(b)未标记的mabesp-1[4b9e7]。点1：纯臭虫卵裂解物；点2：1/5稀释的臭虫卵裂解物；点3：bsa对照；和点4：点在膜上的纯抗体(对照)；

图9是示出了单克隆的mabesp-1和单克隆的mab-esp-3的最佳包被浓度的elisa测定结果的图表。次级偶联物羊抗小鼠hrp被稀释1/5000。mabesp-3的最佳的包被浓度发现为～5-10μg/ml；

图10是示出了竞争性bbp1多克隆elisa检测bbp1肽的结果的图表。通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图11是示出了竞争性bbp1多克隆elisa检测排泄物、蜕皮和死亡的臭虫样品中的bbp1蛋白质的结果的图表。通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图12是示出了检测浓缩的天然和重组截短esp(rtesp)的蛋白质印迹泳道1：分子量标准阶梯，泳道2：臭虫裂解物，泳道3：免疫沉淀的esp蛋白质，泳道4：rtesp。箭头指示了天然esp蛋白质在36.3kda而rtesp在39kda；

图13是示出了检测浓缩的天然和重组截短bbp1(rtbbp1)的蛋白质印迹

泳道1：分子量标准阶梯，泳道2：臭虫裂解物，泳道3：免疫沉淀的bbp1蛋白质，泳道4：rtbbp1。箭头指示了天然bbp1蛋白质在63kda而rtbbp1在39kda；

图14是(a)sds-page凝胶(b)用mabesp-1探测的蛋白质印迹和(c)用mabesp-3探测的蛋白质印迹来示出昆虫裂解物的交叉反应性和抗体对esp蛋白质的特异性。

泳道1：预染色蛋白质分子量标准，泳道2：哈伦品系臭虫全虫裂解物，泳道3：伦敦实验室品系臭虫全虫裂解物，泳道4：哈伦品系臭虫全卵裂解物，泳道5：伦敦实验室品系臭虫全卵裂解物，泳道6：家蛛全虫裂解物，泳道7：家蛾全-虫裂解物，泳道8：蟑螂全虫裂解物，泳道9：蟑螂卵全裂解物，泳道10：土鳖全虫裂解物，泳道11：蜈蚣全虫裂解物，泳道12：家尘螨全裂解物，泳道13：家蝇全虫裂解物，泳道14：蜜蜂全虫裂解物和泳道15：bsa对照(66.5kda)；箭头指示了天然esp蛋白质在36.3kda；

图15是(a)sds-page凝胶(b)用mabbbp1-1探测的蛋白质印迹和(c)用mabbbp1-2探测的蛋白质印迹来示出昆虫裂解物的交叉反应性和抗体对bbp1蛋白质的特异性。

泳道1：预染色蛋白质分子量标准，泳道2：哈伦品系臭虫全虫裂解物，泳道3：伦敦实验室品系臭虫全虫裂解物，泳道4：哈伦品系臭虫蜕皮裂解物，泳道5：伦敦实验室品系臭虫蜕皮裂解物，泳道6：家蛛全虫裂解物，泳道7：家蛾全虫裂解物，泳道8：蟑螂全虫裂解物，泳道9：蟑螂卵全裂解物，泳道10：土鳖全虫裂解物，泳道11：蜈蚣全虫裂解物，泳道12：家尘螨全裂解物，泳道13：家蝇全虫裂解物，泳道14：蜜蜂全虫裂解物和泳道15：bsa对照(66.5kda)；箭头指示了天然bbp1蛋白质在63kda。

图16是(a)sds-page凝胶(b)用mabesp-1探测的蛋白质印迹和(c)用mabesp-3探测的蛋白质印迹来示出热带臭虫和来自不同地理区域的温带臭虫的检测

泳道1：预染色蛋白质分子量标准，泳道2：哈伦品系(美国的-温带臭虫)，泳道3：伦敦实验室品系(杀虫剂敏感的-温带臭虫)，泳道4：伦敦野外品系(拟除虫菊酯抗性的-温带臭虫)，泳道5：肯尼亚野外品系(温带臭虫)，泳道6：肯尼亚热带野外品系(热带臭虫)，泳道7：德国实验室品系(杀虫剂敏感的-温带臭虫)，泳道8：瑞典野外品系(温带臭虫)，泳道9：纯化的天然esp，泳道10：bsa(66.5kda)；箭头指示了天然esp蛋白质在36.3kda。

图17是(a)sds-page凝胶(b)用mabbbp1-1探测的蛋白质印迹和(c)用mabbbp1-2探测的蛋白质印迹来示出热带臭虫和来自不同地理区域的温带臭虫的检测

泳道1：预染色蛋白质分子量标准，泳道2：哈伦品系(美国的-温带臭虫)，泳道3：伦敦实验室品系(杀虫剂敏感的-温带臭虫)，泳道4：伦敦野外品系(拟除虫菊酯抗性的-温带臭虫)，泳道5：瑞典野外品系(温带臭虫)，泳道6：肯尼亚野外品系(温带臭虫)，泳道7：德国实验室品系(杀虫剂敏感的-温带臭虫)，泳道8：肯尼亚热带野外品系(热带臭虫)，泳道9：bsa(66.5kda)；箭头指示了天然bbp1蛋白质在63kda。

图18是示出了mabesp-1[4b9e7]和mabesp-1-hrp抗体的结合曲线的捕获elisa测定结果的rtesp标准曲线，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图19是示出了天然espelisa滴定和其与rtesp的相互关系的结合曲线的捕获elisa测定结果的图表，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图20是捕获elisa对于天然esp的检出限的图表，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图21是示出了捕获elisa对于天然esp的检出限的表格；

图22是示出了检测从环境测试舱中在不同时间段(24小时、72小时、1周、2周、3周和4周)采集的样品中的天然esp的图表；

图23是示出了mabbbp1-1和mabbbp1-1-hrp抗体结合曲线的捕获elisa测定结果的rtbbp1标准曲线，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图24是示出了天然bbp1elisa滴定和其与rtbbp1的相互关系的结合曲线的捕获elisa测定结果的图表，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图25是捕获elisa对于天然bbp1在蜕皮数目方面的检出限的图表，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图26是示出了捕获elisa对于天然bbp1的检出限的表格；

图27是示出了检测从环境测试舱中在不同时间段(24小时、72小时、1周、2周、3周和4周)采集的样品中的天然bbp1的图表，通过测量在450nm和630nm的吸光度得出δod；

图28示出了针对臭虫卵裂解物(a)和bbp1(b)的侧流试验(lateralflowtests)。

泳道1：阴性对照(8m尿素裂解缓冲液)，泳道2：提取的臭虫卵裂解物(a)；和阳性臭虫室样品(b)

图29是示出了(a)mabbbp1-1(b)rtbbp1的抗人类ige检测的斑点印迹，行a：泳道1：0.5mg/mlbsa，行b：泳道1：4μgrtbbp1，泳道2：2μgrtbbp1，泳道3：1μgrtbbp1，泳道4：0.5μgrtbbp1；

具体实施方式

全世界臭虫的快速感染已导致对人类健康影响的日渐关注。

臭虫以人类血液为食。遭受臭虫叮咬可产生皮肤病学反应，可导致在发生叮咬后相当长时间的刺激。叮咬的第一个迹象通常伴随着人们无法清楚知道昆虫在何地或何时叮咬他们。这造成了人可能不知道他们在何地被叮咬的现状。可能是在宾馆中、在朋友家时、沙发或他们的床上。在许多情况下，几个月都没有反应或直到视线看到臭虫或在他们经常进食的地方表面发现了排泄物和血迹。对臭虫的恐惧可以导致焦虑和紧张。

臭虫在世界范围的流行性的增加凸显了检测臭虫存在的改进方法的需求。如果确定臭虫的存在，可随之采取行动来清除该昆虫。或者，如果确定臭虫不存在，人可更容易安睡。

其他人已描述了有限的臭虫检测系统。tolleymp等人(“identificationofbedbug(cimexlectularius)surfacedepositedresiduesasameansofdevelopmentofbedbugdetectiondevices”url:http://esa.confex.com/esa/2011/webprogram/paper54779.html)描述了使用臭虫特异性唾液腺抗原nitrophorin的系统。该系统依赖于对臭虫排泄物中排出的人血特异性的抗原。结果的敏感性表现出是臭虫感染的函数，即低虫口产生不可检测的结果。

wo2013/130613(sri国际)描述了用于体表寄生虫的多克隆抗体检测系统。该系统依赖产生自包含整个动物提取物的免疫原的多克隆抗体。制备的样品发现甚至在不添加任何去污剂时具有显著的可溶性。产生的多克隆抗体的针对整个体表寄生的免疫原的特异性可能不会非常高且可能只检测可溶性蛋白质。

形成鲜明对比，本发明提供了被鉴定且分离的新型温带臭虫蛋白质。分离蛋白质是不溶性蛋白质。虽然该蛋白质可以从臭虫卵、蜕皮和外骨骼以及整个昆虫中轻易地提取出来，但是需要去污剂来溶解分离蛋白质。外骨骼可以来自任何生命阶段的活的或死亡的昆虫。发现针对分离蛋白质和分离多肽产生的抗体可以检测从卵至第1-第5龄期形式至成熟成虫的雌或雄臭虫的生命周期中的所有阶段的抗原的存在。另外，从蜕皮中检测抗原的存在，臭虫在它们的寿命中可以脱落高达五次蜕皮。发现该抗体是非常特异性的，与其他密切相关的体表寄生虫不具有交叉反应性。在蛋白质上的抗体表位区域已被鉴定且发现对该蛋白质是非常特异性的。发现针对表位区域产生的抗体检测样品中的抗原浓度非常低的抗原。

令人惊讶的是，产生的抗体能够检测在普通臭虫物种温带臭虫和发现于热带地区的热带臭虫二者中的蛋白质。使用本发明的特异性抗体的本发明的测定系统在能够鉴定来自不同地理区域的臭虫方面具有全球性的应用。由于气候变化，热带臭虫的出现更常见于更多温带气候。本发明提供了敏感的测定系统，其可在全世界使用来检测臭虫的存在。

一种新型蛋白质发现存在于温带臭虫卵的卵壳中，卵壳蛋白(esp)。

另一种新型蛋白质发现存在于温带臭虫昆虫的所有生命阶段中，臭虫蛋白1(bbp1)。可在温带臭虫的排泄物的沉积物、蜕皮、臭虫卵、成年的臭虫、第1-第5龄期形式[u1]中检测到bbp1。

新型的分离的卵壳蛋白(esp)发现是包括seqidno.1的363个氨基酸的蛋白质。鉴定的抗体表位区域包括seqidno.2和seqidno.3。卵壳蛋白(esp)作为截短蛋白产生，作为稳定esp蛋白质免于降解(在天然esp蛋白质中可见)的方式。预测性结构软件(phyre2,划痕蛋白质预测器(scratchproteinpredictor))显示了esp蛋白质的两个域结构。esp的截短版本发展为包含以v114-c363起始的蛋白质的c末端结构域。制备由251个氨基组成的包括seqidno.4的rtesp蛋白质用于在esp测定中作为标准物。

发现于温带臭虫所有生命阶段(臭虫蛋白1-bbp1)的新型的分离蛋白质发现是包括seqidno.5的651个氨基酸的蛋白质。鉴定的抗体表位区域包括seqidno.6和seqidno.7。bbp1是具有高度重复性氨基酸序列的大蛋白，由于这个原因当构造重组蛋白质时，产生了截短版本的bbp1。蛋白质n末端区域的280个氨基酸用于产生包括seqidno.8的截短重组蛋白质。

新型分离的温带臭虫蛋白质发现不具有类似于其他昆虫蛋白质的pfam结构域。包括seqidno.1的卵壳蛋白发现仅存在于温带臭虫的卵壳中。包括seqidno.5的臭虫蛋白1—bbp1发现存在于温带臭虫的排泄物的沉积物中和蜕皮、卵、成虫和第1-第5龄期形式中。

根据本发明，蛋白质或多肽序列的变体或片段包括保守性取代或修饰以便它们保留蛋白质的免疫原性特性。变体还可或可替换地包含其他修饰，该修饰包括删除或添加对多肽的抗原性特性具有最小影响的氨基酸。

天然卵壳(esp蛋白质)蛋白质和臭虫蛋白1(bbp1蛋白质)蛋白质通过差异蛋白提取来纯化，并通过蛋白质印迹方法检验抗体特异性。

已经在蛋白质上鉴定出抗体表位区域，且已使用对于新型温带臭虫蛋白质特异性的单克隆抗体和多克隆抗体二者开发敏感的检测测定。新型蛋白质的分离和鉴定以及产生的针对新型蛋白质的抗体提供了用于检测样品中臭虫的潜在应用。该测定可用于检测在所有生命阶段温带臭虫的存在。

发现针对该蛋白质产生的抗体的敏感性非常高。该抗体能够检测样品中低于20μg/ml的抗原浓度水平。该抗体能够检测低至1-3μg/ml的抗原浓度水平。

使用针对新型蛋白质上的抗体表位区域产生的抗体开发测定系统。

使用本发明的抗体的检测测定在很多领域具有有价值的应用。使用抗体的检测测定允许人快速且容易地确定样品中臭虫的存在或不存在。家庭用户或宾馆将能够毫无疑问的确定在环境中不存在臭虫。同样地，个体旅行者将能够携带易于使用的测定试剂盒来确认宾馆的房间或床是否没有臭虫。拥有具有快速读取结果的检测测定试剂盒将非常有益于快速确定在环境中臭虫存在或不存在。可能开发不同类型的检测测定诸如例如elisa测定或侧流试验或任何其他快速测定平台。本发明的抗体可以在测定形式中使用，表面呈现于阵列、纳米颗粒或膜上和/或以悬浮液形式呈现。

浸渍棒试验(dipsticktest)形式的侧流免疫层析检测方法用于检测臭虫的存在，并发现其提供了一种快速且高敏感的检测方法。(图28)在使用中，从被检测的区域中取样并可置于稀释液中。以单克隆附着的样品垫浸渍在样品稀释液中，且线的可视化表明臭虫的存在。

使用本文公开的抗体来检测样品中臭虫的存在的其他形式将对本领域的技术人员是明显的。

对臭虫过敏的事件呈上升趋势且可导致明显的不适和不健康。虽然对臭虫叮咬的敏感性看起来随着重复暴露而增加，然而叮咬及其随后的反应经常被误诊。能够确定人是否对臭虫特异性过敏的能力将会非常有价值。

已发现，本发明的新型蛋白质可用在过敏原检测中。臭虫蛋白在叮咬或暴露后引起ige免疫应答。该应答可导致很多不同的症状包括伤痕和哮喘。皮肤点刺测试(spt)显示对特异性过敏原的过敏性应答。使用本发明的新型蛋白质的spt可用来确认对臭虫过敏症的存在。特异性诊断将有助于治疗的选择，且还有助于通过回避来预防症状的复发。

本发明将通过以下的实施例进一步得到说明。

实施例1-从温带臭虫卵中提取天然esp

喂食后3天收集温带臭虫卵并允许孵化。孵化的卵重悬在尿素裂解缓冲液(8m尿素、2m硫代尿素、ph8.0的25mmtris、150mmnacl、1mmedta、1mmegta和1％tritonx-100)中，并在1分钟脉冲内进行3次超声处理。样品在27000×g离心10分钟来分离样品中可溶的和不可溶的部分。

从250枚卵获得的天然蛋白质的产量近似于6.2mg的总纯化的天然蛋白质。

实施例2-从温带臭虫的整个躯体和蜕皮中提取天然bbp1

将死亡的臭虫昆虫和蜕皮重悬在尿素裂解缓冲液(8m尿素、2m硫代尿素、ph8.0的25mmtris、150mmnacl、1mmedta、1mmegta和1％tritonx-100)中，且以1分钟脉冲涡旋进行5分钟。样品在27000×g离心10分钟来分离样品中可溶的和不可溶的部分。从10个蜕皮中得到的天然蛋白的产量近似于30μg总纯化的天然蛋白。

提取和分离的新型蛋白质发现是不可溶蛋白质因为单使用pbs不能成功提取它们。对两种蛋白质需要使用去污剂来使其完全溶解。

实施例3-小鼠单克隆抗体(mab)的产生和克隆的选择

针对臭虫卵壳蛋白表位(esp)1-seqidno.2和表位3-seqidno.3的六种小鼠igg单克隆抗体(mab)，以及针对臭虫蛋白1表位1(bbp1)seq-idno.6和表位2–seqidno.7的四种小鼠iggmab产生自小鼠杂交瘤细胞系，(genscriptusainc生产，依商业基础)。合并mabesp-3的两个克隆显著增加了免疫反应的敏感性。所选择的单克隆抗体的表格在图1和图2中示出。

杂交瘤细胞在以10％fbs补充的dmem+l谷氨酰胺+抗生素中扩增，一旦杂交瘤细胞在t175组织培养瓶中稳定，10％的fbs降低至2％fbs。为了产生抗体，杂交瘤细胞生长直到培养基变黄以及细胞死亡(约2周)。通过在4℃以最大速度(4300×g)离心30分钟收集上清液。

通过在4℃硫酸铵沉淀(50％)过夜，mab从杂交瘤细胞上清液中纯化。沉淀的抗体在pbs中重悬，且透析/缓冲液交换来移除盐。mabesp-1[4b9e7]、mabesp-3[4d1b8&10b9f9]、mabbbp1-1[5d3e8]和bbp1-2[10b1c5]用hi-trapg蛋白柱(ghhealthcare)依据制造说明书进一步纯化。简而言之，透析的硫酸铵沉淀的mab经由0.45μm过滤器过滤。这些随后经过1mlg蛋白柱(gehealthcare)。用pbs(5倍柱体积×3次)将未结合的蛋白质从柱上洗掉。mab通过甘氨酸-hcl(0.1m、ph＝6.5)洗脱、浓缩并随之在4℃下对pbs(ph＝7.5)透析过夜。在纯化过程中的吸光度使用aktastartflpc系统在280nm波长处监测。纯化的mab浓度在od280nm计算。

图3示出了纯化的针对esp的单克隆抗体通过g蛋白柱洗脱，(a)mabesp-1和(b)mabesp-3。图4示出了纯化的针对bbp1的单克隆抗体通过g蛋白柱洗脱，(a)mabbbp1-1和(b)mabbbp1-2。mab的纯度通过在还原和非还原的条件下的sds-page评估。图5示出了mabesp-1和mabesp-3的纯化sds-page。图6示出了mabbbp1-1和mabbbp1-2的纯化sds-page。

实施例4-多克隆抗体的生成

针对esp蛋白质的多克隆抗体由genscriptusainc，依商业基础生成。简而言之，对esp生成两种肽，包括seqidno.2的esp-1和包括seqidno.3的esp-3，以及对bbp1生成一种肽，包括seqidno.7的bbp1-2。这些肽与载体蛋白偶联且每种肽用于免疫两只兔。多克隆抗体被亲和纯化并经elisa检验。

图7(a)示出了纯化的天然esp蛋白质在sds-page蛋白凝胶上运行。图7(b)是使用兔多克隆抗体抗esp-3探测的蛋白质印迹来鉴定esp蛋白质。

实施例5-esp-1[4b9e7]mab的生物素化.

针对esp的单克隆抗体被生物素化来放大抗esp蛋白质的抗体信号。

纯化的mabesp-1[4b9e7]在2-8℃对几次更换的碳酸盐缓冲液[ph9.5的包含0.1％nan3的0.1m碳酸钠缓冲液(nahco3/na2co3)]透析。透析后，调节蛋白质的浓度至2mg/ml。在使用前不久，将nhs-d-biotin(sigma)溶解在dmso中达到2mg/ml的浓度(使溶液避光)。使用与免疫球蛋白溶液总体积的10％相等的体积，nhs-d-biotin溶液伴随着温和搅拌被按份添加到单克隆抗体溶液中，且在旋转轮上室温孵育4小时。将反应溶液在4℃对几次更换的pbs缓冲液(0.01m磷酸钠，0.15m氯化钠，ph7.4，包含0.1％nan3)透析来移除任何未结合的生物素。透析后，将生物素化的mabesp-1[4b9e7]保存在-20℃的黑暗中(因为生物素是光敏感的)。

生物素化效率经斑点印迹分析(图8)检验。已发现，生物素化改进了单克隆抗体的效率。

实施例6-确定最佳包被浓度的捕获elisa

用在ph9.6的50mm碳酸盐缓冲液中连续稀释(20-0.312μg/ml)的mabesp-1或mabesp-3以100μl/孔包被96孔elisa板并在室温下孵育过夜。包被的elisa板用pbst(pbs+0.05％tween-20)洗涤3次并在室温下封闭(在碳酸盐缓冲液ph9.6中的10％蔗糖、1％bsa)2小时。洗涤后，以1/4000稀释的羊抗小鼠抗体以100μl/孔添加并在室温孵育一小时。elisa板用pbst洗涤4次并用100μl/孔的超tmbelisa检测试剂使其可视化。5分钟后，使用h2so4停止反应。测量在450nm和630nm的吸光度并用来计算δod值。(图9)

实施例7-使用bbp1多克隆竞争elisa来检测样品中温带臭虫的全虫和蜕皮的测定法

bbp1生物素化

用ez-连接硫代-nhs生物素(ez-linksulfo-nhsbiotin)(thermofisher)依据制造说明书使bbp1蛋白质(seqidno.7)生物素化。简而言之，bbp1肽与20倍过量的硫代-nhs生物素混合并在室温在旋转下孵育30分钟。样品随即过c18柱(pierce)来从反应的bbp1-生物素中移除游离生物素。

bbp1elisa的样品提取

5个蜕皮、5个死亡的臭虫和1cm排泄物纸在500μltbs盐水(25mmtris、150mmnacl、ph7.20.1％bsa、0.05％tween20)中在旋转下孵育2.5小时。样品使用纯的。

竞争elisa

中性抗生素蛋白板(neutravidinplates，pierce)依据制造说明书使用。elisa板用100μl在tris缓冲的盐水(25mmtris、150mmnacl、ph7.20.1％bsa、0.05％tween20)中的bbp1-生物素肽(2.5μg/ml)包被，并在室温下孵育2小时。elisa板用tbs洗涤3次，之后添加50μl肽(各种浓度)或样品(纯的)以及50μl抗-bbp1多克隆抗体(最终500ng/ml或1μg/ml)。板在室温下孵育1小时，并洗涤3次，之后添加以1/2500稀释的100μl抗-兔-hrp。tmbelisa检测试剂用于使信号可视化，而h2so4用于在5分钟后停止反应。通过测量在450nm和630nm的吸光度得到δod。

该测定法能够检测低水平的bbp1蛋白质。bbp1抗体能够检测水平低至2.5μg/ml的合成的bbp1肽(图10)。bbp1抗体还能够检测从排泄物纸、蜕皮和死亡的臭虫中提取的纯样品中的天然bbp1蛋白质(图11)。

实施例8-重组蛋白质纯化

esp截短蛋白和bbp1截短蛋白(rtesp和rtbbp1)的基因作为g块(gblocks)生成(整合dna技术)并克隆至pet32a载体中。依据制造说明书，蛋白质在用于rtesp-pet32a细胞的origami(de3)plyss(novagen)或用于rtbbp1-pet32a细胞的bl21(de3)plyss(novagen)中表达。重组蛋白质在包涵体中表达。细菌沉淀(bacteriapellets)在裂解缓冲液(5％tritonx-100、0.1mmpmsf、磷酸盐缓冲液(250mm磷酸盐、ph8.0、300mmnacl))中重悬，并在50％最大功率下超声处理(syclon,超声波均质机)直到裂解物清澈。包涵体在27000×g下成粒15分钟，然后再在洗涤缓冲液i(50mmtris、ph8.0、0.5％tritonx-100、1mmdtt磷酸盐缓冲液)中洗涤一次，且然后在洗涤缓冲液ii(50mmtris、ph8.0、1mmdtt、磷酸盐盐水)中洗涤。蛋白质沉淀然后在蛋白质重悬缓冲液(6mguhcl、10mm咪唑、磷酸盐缓冲液)中重悬。

用mabbbp1-1cnbr琼脂糖凝胶柱将rtbbp1进一步纯化。rtbbp1悬浮液过柱子并用10倍柱体积的pbs洗涤。用ph3的100mm甘氨酸从柱子中洗脱蛋白质，并用ph8.0的1mtris将其缓冲。

实施例9-天然esp和bbp1的富集和检测

使用mabesp-3/mabbbp1-1cnbr琼脂糖凝胶柱，在tsa(10mmtris、ph8.0、140mmnacl)中将天然esp和bbp1蛋白质从臭虫卵裂解物和臭虫整个裂解物中免疫沉淀出来。通过用洗涤缓冲液(500mmnacl、10mmtrisph8.0、1％tritonx-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％sds)和tsa洗涤珠子六次来移除未结合的蛋白质。富集的样品在还原条件下通过12.5％sds-page分离。蛋白质样品被转移到硝化纤维素膜上。

用5％奶粉的pbst封闭硝化纤维素膜。用1/1000稀释的mabesp-1或mabbbp1-1探测膜1小时。硝化纤维素膜用pbst洗涤三次，随后用1/2000稀释的抗小鼠-hrp探测1小时。该膜用pbst洗涤三次，并用dab(3,3’-二氨基联苯胺)底物使信号可视化。

在图12中示出了天然和重组的截短esp的检测结果。箭头指示天然esp蛋白质在36.63kda而rtesp在40kda。

在图13中示出了天然和重组的截短bbp1的检测结果。箭头指示天然bbp1蛋白质在63kda而rtbbp1在39kda。

实施例10-用来确定针对esp蛋白质和bbp1蛋白质的单克隆抗体的交叉反应和抗体特异性的免疫印迹

针对与国内环境相关的一些昆虫和它们的卵来检查针对esp和针对bbp1的单克隆抗体的交叉反应性。收集昆虫并随之在液氮中冰冻，并用杵和研钵碾碎。

碾碎的裂解物在尿素裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂(ph8)中重悬。蛋白质通过温和搅拌2小时提取出来。然后裂解物在27000×g下离心来移出可溶性上清液。可溶性上清液被移出，并通过旋转过滤柱过滤。蛋白质的浓度通过bradford测定法确定，且使用具有低分子量截留的contricon设备浓缩稀释的蛋白质裂解物。样品然后载入12.5％sds-page凝胶并在还原条件下运行。结果在图14(a)中示出。

电泳后，蛋白质被转移至硝化纤维素膜上来探测各纯化的mab。

用5％奶粉的pbst封闭硝化纤维素膜。用1/1000稀释的mabesp-1、mabesp-3和1/2000稀释的mabbbp1-1和mabbbp1-2探测该膜1小时。用pbst洗涤该硝化纤维素膜三次，随之用1/2000稀释的抗小鼠-hrp探测1小时。用pbst洗涤该膜三次并用dab(3,3’-二氨基联苯胺)底物使信号可视化。

图14(b)示出了用mabesp-1探测的结果。图14(c)示出了用mabesp-3探测的结果。箭头指示天然esp蛋白质在36.3kda。

现已发现单克隆抗体对哈伦品系臭虫全卵裂解物和伦敦实验室品系臭虫全卵裂解物(图14(b)和图14(c)泳道4和泳道5)二者具有非常特异性。没有发现与测试的其他卵有交叉反应性。

实施例11-用来确定针对bbp1蛋白质的单克隆抗体的交叉反应性和抗体特异性的免疫印迹

如上文实施例所述，针对与家庭环境相关的一些昆虫来检查抗bbp1单克隆抗体的交叉反应性。

图15(a)示出了样品在还原条件下在12.5％sds-page凝胶上运行。

图15(b)示出了用mabbbp1-1的探测结果。图15(c)示出了用mabbbp1-2的探测结果。箭头指示天然bbp1蛋白质在63kda。

已发现单克隆抗体对哈伦品系臭虫全虫裂解物和蜕皮裂解物，以及伦敦实验室品系臭虫整个裂解物和蜕皮裂解物(图15(b)(c)泳道2至泳道5)二者具有特异性。没有发现与测试的来自其他昆虫的任何其他裂解物有交叉反应性。

实施例12-用来研究热带臭虫和来自不同地区的温带臭虫的检测的免疫印迹

从不同地区收集的一些温带臭虫和臭虫卵以及来自热带肯尼亚的臭虫物种(热带臭虫)如上文所述在尿素裂解缓冲液中提取。样品在27000×g下离心分离10分钟来分离可溶的和不可溶的样品部分。可溶部分的浓度通过bradford测定法确定，且所有样品被稀释至相同浓度并通过在还原条件下的12.5％sds-page分离。蛋白质转移到硝化纤维素膜上并如上文所述运行蛋白质印迹。

esp的在还原条件下的sds-page结果在图16(a)中示出。使用mabesp-1显示检测的蛋白质印迹在图16(b)中示出，使用mabesp-3显示检测的蛋白质印迹在图16(c)中示出。箭头指示天然esp蛋白质在36.3kda。

bbp1的在还原条件下的sds-page结果在图17(a)中示出。使用mabbbp1-1显示检测的蛋白质印迹在图17(b)中示出，使用mabbbp1-2显示检测的蛋白质印迹在图17(c)中示出。箭头指示天然bbp1蛋白质在63kda。

令人惊讶的是，现已发现单克隆抗体不仅对于温带臭虫的esp和bbp1，还对热带臭虫的esp和bbp1具有特异性(图16泳道6和图17泳道8)。

实施例13-实地试验

建立环境测试舱来复制宾馆房间，包含床、床边柜和椅子。贯穿研究始终，控制该舱的温度(23℃)和相对湿度(45％±5％)。以每周间隔将喂食的臭虫(混合生命阶段)引入该舱中。引入的臭虫的数目在每个连续星期加倍来监测主动感染的指数效应。1周后将人工喂食器引入舱内以允许臭虫在舱内进食一次。真空样品取自于在研究的24小时和48小时和1周、2周、3周和4周已知臭虫活动的区域。

实施例14-捕获elisa

96孔elisa板用100μl/孔的在ph9.6的50mm碳酸盐缓冲液中的mabesp-3或mabbbp1-1(5μg/ml)包被，并在4℃孵育过夜。包被的elisa板用pbst(pbs+0.05％tween-20)洗涤3次并在室温下封闭(在碳酸盐缓冲液ph9.6中的10％蔗糖、1％bsa)2小时。将提取的臭虫样品1/4稀释到pbst中，然后用1％bsa在elisa板上连续稀释(1:2)，且在室温下在板振动平台上孵育1h。洗涤后，以1/500稀释的mabesp-1-hrp或mabbbp1-2-hrp以100μl/孔添加并在室温下孵育一小时。elisa板用pbst洗涤3次并使用100μl/孔的超tmbelisa检测试剂可视化。在10分钟后，使用h2so4停止反应。测量在450nm和630nm的吸光度并用来计算δod值。

rtesp蛋白质标准曲线在图18中示出。天然espelisa滴定和与rtesp的相互关系在图19中示出。显示了检出限(lod)的elisa的结果在图20中示出。抗体能够检测浓度低于10μg/ml的esp蛋白质的存在。测定法能够检测包含少至1至2个臭虫卵的样品中的esp蛋白质。(图21)

在控制舱内不同时间段使用elisa检测臭虫卵的结果在图22中示出。

rtbbp1蛋白质标准曲线在图23中示出。天然bbp1elisa滴定和与rtbbp1的相互关系在图24中示出。通过昆虫蜕皮的方式显示了检出限(lod)的elisa的结果在图25中示出。抗体能够检测以低于10μg/ml浓度存在的bbp1蛋白质。该测定法能够检测包含来自臭虫的少至1个蜕皮的样品中的bbp1蛋白质。(图26)

在控制舱内不同时间段使用elisa检测臭虫的结果在图27中示出。

实施例15-乳胶-mab偶联物的生成：

在10％w/v溶液中的100μl的400nm的羧化微球用激活缓冲液(50mmmesph6.0)洗涤三次。微球的羧基基团在室温下用4.8mm1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺(edc)和48mmn-硫羟基琥珀酰亚胺(硫代-nhs)激活30分钟。然后微球用激活缓冲液洗涤两次，之后在激活缓冲液中添加50mg/g的抗体(mabesp-1或mabbbp1-2)。微球:抗体溶液在4℃混合过夜。1％的微球溶液用30μl的乙醇胺在室温下淬灭30分钟，然后用封闭缓冲液(50mmtris，ph8.0和1％酪蛋白)在室温下在旋转下封闭3小时。接着使用封闭缓冲液进行两轮洗涤，将微球以1％的终浓度重悬在封闭缓冲液中。贯穿该过程始终将微球以间隔进行超声处理以确保颗粒的单分散。

不同浓度的抗体可以被施用于微球，且针对esp蛋白质和针对bbp1蛋白质的不同抗体也可以被使用。该方法不限于加入bsa结合步骤来增加抗体浓度水平。

实施例16-准备侧流测试

侧流检测由可用在盒式(cassettes)或其他快速检测形式中的浸渍棒模型(dipstickmodel)组成。hiflowplus膜(millipore)附着在卡片背面的膜上，并使用mabesp-3(5mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml))或mabbbp1-1(6mg/ml、3mg/ml、1mg/ml)的测试线和抗小鼠(250ug/ml)的对照线喷射。

将如上文所述制备的乳胶偶联物(mabesp-1和mabbbp1-2)稀释至在偶联缓冲液(2％鱼皮明胶、1％蔗糖、1％tritonx-100、1％tween20、1.5mg/mlpeg4000)中0.05％-0.1％的浓度，并然后被施用于玻璃纤维膜且在37℃干燥72小时。玻璃纤维膜也用作样品垫并用偶联缓冲液预处理，并在与偶联垫相同条件下干燥。

侧流测试通过略微重叠吸光度垫到被喷射的膜的上部以及偶联垫到被喷射的膜的下部来构建。样品垫与测试下部的偶联垫略微重叠。在被切割成75mm×4mm的测试条之前，膜在37℃干燥24小时。侧流条对臭虫舱样品和卵裂解物进行测试。尿素裂解缓冲液用作对照。阳性结果在图28(a)-esp和图28(b)-bbp1中示出。

可使用其他的采样法，例如可取区域的拭子(swab)或擦拭物(wipe)并将拭子或擦拭物添加到稀释剂中，随后侧流条被浸渍其中。

实施例17-金-mab偶联物的生成

制备金-mab偶联物用于在侧流测试中使用。

未缓冲的胶体金缓冲至ph7.5，之后将10μg/ml的mab(mabesp-3)添加到溶液中并旋转2小时。金mab偶联物用bsa封闭液在室温下封闭2小时。金mab偶联物被彻底洗涤

金mab偶联物(mabesp-3)以1.5-2.5的od范围用在偶联缓冲液(2％鱼皮明胶、1％蔗糖、1％tritonx-100、1％tween20、1.5mg/mlpeg4000、1.5mg/mlpvpk-30)中，且然后施用于玻璃纤维膜并在37℃干燥72小时。玻璃纤维膜还用作样品垫，并用偶联缓冲液预处理，并在与偶联垫相同的条件下干燥。

实施例18-过敏原测试

rtbbp1以滴定浓度(4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml)被点到硝化纤维膜上，bsa(0.5mg/ml)用作对照。硝化纤维素膜用5％奶粉的pbst封闭。该膜用人类血清或1/1000稀释的mabbbp1-1探测。硝化纤维素膜用pbst洗涤三次，然后1/2000稀释的抗小鼠-hrp或1/500稀释的抗-人ige-过氧化物酶1小时。该膜用pbst洗涤三次，用dab(3,3’-二氨基联苯胺)底物使信号可视化。斑点印迹的结果在图29中示出。

本发明提供了能够检测极低浓度水平的温带臭虫和热带臭虫二者的多克隆抗体和单克隆抗体。单克隆抗体在用来检测臭虫特异性抗原的使用点测定法(point-of-useassays)中具有有价值的应用。测定方法可能包括elisa测定或侧流免疫层析测试。使用者可以抽真空、拭或擦一个区域并将样品插入到读取器中。可以检测到非常低的臭虫虫口(population)。可选的试剂可包括溶解来自收集设备中的臭虫样品的溶液。

当然可以理解，本发明不限于仅通过示例的方式给出的如本文所述的具体细节，并且各种改变和变更在不背离本发明在所附权利要求中限定的范围的情况下是可能的。

序列表

<110>爱尔梅德健康集团有限公司(airmidhealthgroupltd)

<120>新型蛋白质以及检测方法

<130>p15641

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>363

<212>prt

<213>温带臭虫（cimexlectularius）

<400>1

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<213>温带臭虫（cimexlectularius）

<400>3

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1510

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<213>温带臭虫（cimexlectularius）

<400>4

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<213>温带臭虫（cimexlectularius）

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