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发明领域
本发明涉及重组腺病毒载体化prrsv疫苗、组合物和使用方法。
发明概述
prrsv为猪的破坏性病毒感染,具有巨大的经济重要性(deraldj.holtkamp,2013)。不同分离株的抗原特征存在较大变异性,且预防感染的有效措施有限。prrs可用的疫苗有两大类,其为经减毒修饰的活病毒(mlv)或经杀死的病毒疫苗。尽管在同源物攻击方面有效,但mlv疫苗无法在许多循环变体之间提供更广保护且具有恢复至野生型引起爆发性感染的可能性。此外,用mlv接种的动物持续散出病毒,且使用此疫苗的农场不可能无prrsv。另一方面,与mlv疫苗相比,经杀死的病毒疫苗安全得多,但不太有效。因此,可用于预防感染的当前选择既不安全也不有效(charerntantanakul,2012)(tjeerdg.kimman,2009)。在过去二十年的大部分时间中,已有开发可解决当前疫苗的主要缺点的重组疫苗的一致努力(zhang,2012)。然而,尽管做了大量工作,但市场上尚无特许用于预防prrsv感染的单一重组疫苗。过去评估的大部分重组疫苗是基于据信为中和抗体反应的靶标的病毒包膜蛋白中的一种或组合。然而,缺少对包膜蛋白之间或与靶标细胞上受体的功能性相互作用的彻底理解妨碍了有效重组疫苗的合理设计。
prrsv的病毒包膜蛋白通常基于蛋白在病毒粒子中的丰度归类为主要和次要蛋白(dokland,2010)(deas,2000)。主要病毒包膜蛋白为gp5(orf5)和m(orf6)且形成二聚物。次要包膜蛋白为gp2(orf2)、gp3(orf3)、gp4(orf4)和e(orf2b)且很可能为新鉴别出的病毒蛋白gp5a(orf5a)。据信次要包膜蛋白以多聚物形式存在,且其涉及与受体cd163的直接相互作用且介导病毒进入(phanib.das,2010)。
大部分先前开发重组疫苗的尝试集中于主要蛋白gp5、m或组合(dea,1998)。此很可能由于主要蛋白的抗体在prrsv感染动物中易于检测且假设其可能将中和靶标呈现至免疫系统。此外,gp5中的较大程度序列变异性指示这些蛋白处于免疫选择压力下。然而,gp5特异性抗体自中和血清中耗尽指示这些抗体基本上属于血清的非中和部分(juanli,2012)。因此,这些已指示除主要蛋白以外,主要中和靶标存在于病毒包膜蛋白上且很可能存在于次要蛋白上。尽管已作出大量工作将主要蛋白开发为重组疫苗(在经纯化重组蛋白至使用多种载体平台递送的疫苗范围内)中的抗原(jazminal.g.cruza,2010),但由于未能获得稳健的保护而尚未使其面市。
近来,对开发重组prrs疫苗的关注已偏移至次要蛋白(jing-qiangren,2014)(sakthivelsubramaniam,2014)(z.s.wang,2011)。此偏移已主要由三项近来的发现驱动。第一,两种次要蛋白gp2和gp4展示出直接结合至cd163受体。第二,次要蛋白而非主要蛋白与eav(马动脉炎病毒(equinearteritisvirus),也为动脉炎病毒(arterivirus))的交换改变病毒的向性,指示次要蛋白在与受体相互作用以及引导病毒至靶标细胞中的重要性(luz1,2012)(tiand,2012)。最后,cd163(其为次要蛋白的主要受体)的基因敲除突变体预防病毒感染,而cd169(主要蛋白的受体)的类似基因敲除不影响病毒进入(randalls.prather,2013)。尽管在次要蛋白在病毒进入中的作用以及作为中和抗体反应的相关靶标方面的知识渐增,但迄今为止基于次要蛋白开发的重组疫苗中无一个会产生经接种动物免于prrs感染的保护。
此处,我们呈现将另一次要蛋白e包括在此次要蛋白组合中会产生显著不同的保护性应答。出人意料地,e蛋白以及gp2、gp3和gp4的存在诱导了稳健的免疫反应且减少了来自prrs攻击的肺损伤。此为第一次展示e蛋白是能诱导保护性免疫反应的蛋白复合物的至关重要的组分。此不仅通过将e蛋白鉴别为次要蛋白复合物的必需组分,而且通过自促进蛋白复合物形成的单一载体平台表达所有四种蛋白来获得。此新发现将不仅用来进一步理解病毒蛋白与细胞受体之间的重要相互作用,而且奠定了获得实际上不含活prrsv的通用重组prrs疫苗的基础。
在我们手中,用汇集的表达gp2、gp3和gp4的质粒接种动物未能产生稳健的免疫反应(未公开的观察结果)。来自此动物试验的结论为:推测这些蛋白以多聚物形式存在,且因此需要所有蛋白在单一细胞内同时表达以促进多聚化,从而形成将中和表位呈现至免疫系统的正确构象。后续生物化学分析也表明了这一点,所有蛋白被放置在单一载体中以允许同时表达。出人意料地,在此处报导的动物试验中,我们已发现这还不足以诱导保护性免疫反应。实际上,利用这些抗原诱导保护性免疫反应的至关重要的因素为所引入的使蛋白自胞内区室重新靶向至细胞表面的修饰。经修饰与未经修饰蛋白之间的这样的显著差异完全出人意料且将开放用于解决在多种病毒靶标情况下类似挑战的新途径。据我们所知,这也是首次发现prrsv包膜次要蛋白的免疫原性在一定程度上增强,其可通过自单一载体同时表达所有次要蛋白且引入增强细胞表面表达的修饰来获得针对prrs攻击保护免于肺损伤以及降低血清病毒血症水平。
参考文献
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本发明提供新颖的prrsv疫苗组合物及其制造方法与用途。
本发明部分基于以下惊人且出人意料的发现:将另一prrsv次要蛋白(e)包括在其他次要蛋白的组合中会产生显著不同的保护性应答。在一些实施方案中,足够量的e蛋白,例如其跨膜(tm)、氨基末端(nt)或其羧基末端(ct)结构域可以用于引发所述保护性应答。
出人意料地,e蛋白以及gp2、gp3和gp4的存在诱导了稳健的免疫反应且减少来自prrs攻击的肺损伤。此为第一次e蛋白展示为能诱导保护性免疫反应的蛋白复合物的至关重要的组分。
照此,所公开的疫苗不仅通过将e蛋白鉴别为次要蛋白复合物的必需组分来获得,而且通过自促进蛋白复合物形成的单一载体平台表达所有四种蛋白来获得。
在另一方面中,本发明提供prrsv次要蛋白的重组病毒载体表达嵌合形式,如与其相应的野生型基因相比,其含有不同的细胞定位决定子。具体地,已添加vsv糖蛋白(g)和组织纤维蛋白溶酶原活化因子蛋白(tpa)的一部分以引起所得嵌合基因产物定位至细胞表面。这些重组载体引发宿主动物针对prrsv的安全且有效的免疫反应。照此,引入至prrsv次要蛋白中以获得其表面表达的修饰产生了与共同表达e蛋白以及gp2、gp3和gp4的类似作用。
因此,本发明由此提供用于获得100%不含活prrsv的通用重组prrs疫苗的路线图。
本发明更尤其涉及一种腺病毒载体化prrsv疫苗或组合物,其包含一种或多种具有且表达某些prrsv抗原的工程化重组腺病毒载体和任选选用的药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。prrsv可为任何病毒株,因为出于以下更充分论述的原因,本文公开的新颖且创造性的组合物和方法普遍地适用于所有已知和尚待发现的prrsv病毒株。
prrsv抗原包括任何组合形式的prrsv次要蛋白(例如gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e),并且任选包括额外的prrsv主要蛋白(例如gp5或m)。与其他次要蛋白相似,gp5a相对高度保守,并且被申请人设想为本发明的安全并且有效的重组病毒载体的有效添加或取代。
prrsv重组载体可在动物宿主中含有并且表达至少以下基因或组分(rtg=重新靶向;cmv=巨细胞病毒启动子;sv40=猴病毒40启动子;ires=内部核糖体进入位点,自身裂解2a肽,来源于口蹄病(fmd)病毒、马鼻炎a病毒、明脉扁刺蛾β四体病毒(thoseaasignavirus)或猪捷申病毒-1)的组合(按任何次序,并且由任何启动子组件pe驱动,包括所指明的一个,并且包括诸如ires和2a-肽的组件):1)(pe)gp2,(pe)gp3,(pe)gp4,(pe)e;2)(pe)rtggp2,(pe)gp3和(pe)gp4;3)(pe)rtggp2,(pe)rtggp3和(pe)rtggp4;4)(pe)rtggp2,(pe)rtggp3,(pe)rtggp4和(pe)e;5)(pe)rtggp2,(pe)rtggp3,(pe)rtggp4和(pe)rtge;6)(pe)rtggp2,(pe)rtggp4和(pe)rtge;7)(pe)rtggp2和(pe)rtggp4,8)(m-(sv40)-(cmv)-gp5-(ires)-gp5a;9)gp2-(sv40)-(cmv)-e;10)rtggp2-(sv40)-(cmv)-e;11)rtggp2-(sv40)-(cmv)-rtge;12)(cmv)-e;11)e-(p2a)-gp2-(sv40)-(cmv)-gp4;12)rtge-(p2a)-rtggp2-(sv40)-(cmv)-rtggp4;13)(pe)gp2-(pe)gp4-(pe)e;14)(pe)gp2-(pe)e;15)(pe)gp2;16)(pe)gp2-(pe)gp3;16)(pe)gp2-(pe)gp4;17)(pe)gp2-(pe)gp5a;18)(pe)e;19)(pe)e-(pe)gp3;20)(pe)e-(pe)gp4;19)(pe)e-(pe)gp5a;20)。在一个有利的实施方案中,载体含有并且表达至少野生型或其“rtg”形式的(pe)gp2、(pe)gp4和(pe)e。载体也可有利地包含gp2加编码prrsv多肽的任何其他基因。
重新靶向可通过分别用vsv的tm和ct结构域置换现有gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e蛋白跨膜(tm)和细胞质尾(ct)结构域来实现。在一个实施方案中,gp5和m蛋白也可经历重新靶向程序。天然prrsv蛋白序列此外或替代地可被tpa信号序列以及vsv的tm和ct中的一个或两个(或来自其他适合的表面表达多肽的那些相同组件)置换。或者,重新靶向可通过用vsv的ct结构域置换现有gp2、gp3、gp4、gp5a、e、gp5或m蛋白ct结构域(也即,不改变现有tm结构域)来实现。e的重新靶向也可通过用来自ii型膜蛋白的序列、或用vsv-g或其组合、或其他表面糖蛋白的tm/ct结构域置换其细胞定位信号来实现。
申请人进一步设想将prrsv抗原呈现至宿主动物的免疫系统的许多替代手段。举例而言,抗原可呈现在病毒样粒子(vlp)的表面上。在其他实施方案中,抗原的可溶形式可施用至宿主动物,其中蛋白彼此寡聚化(包括三聚化),或另外与vsv-g的组分或其他病毒蛋白寡聚化,或任何寡聚化(包括三聚化基序)(例如来自细菌gcn4的基序及其类似物)。此外,设想i型病毒表面糖蛋白的tm/ct结构域实现与来自vsv-g的相应的结构域相同的目的,并且因此可与来自vsv-g的相应的结构域互换。
因此,现已公开本发明,本领域技术人员将认识到用于实现基本上相同的呈现prrsv次要蛋白(包括e、gp2、gp3、gp4、gp5a)、主要蛋白(包括gp5和m),或次要和/或主要蛋白的组合)至宿主动物的免疫系统的许多替代和功能等效的方式。
本发明也涉及一种接种动物的方法,其包括向动物施用有效量的一种或多种疫苗或组合物,一种或多种疫苗或组合物可包含有效量的腺病毒载体化prrsv疫苗和任选药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。施用可为皮下、鼻内、肌肉内、经皮、皮内、黏膜(包括经口)或任何其他施用。
本发明进一步涉及使用初免-加强方案施用疫苗或组合物。本发明进一步包括一种用于执行引发或诱导免疫反应的方法的试剂盒,其可包含重组ad5免疫组合物或疫苗或灭活的免疫组合物或疫苗中的任一个和用于执行方法的说明书。
因此,本发明的一个目标为在本发明内不包括任何先前已知的产品、制备产品的工艺,或使用产品的方法,使得申请人有权并且在此公开任何先前已知产品、工艺或方法的免责声明。另外注意,本发明不希望在本发明的范畴内包括不符合书面说明和uspto的启用要求(35u.s.c.§112,第一段)或epo(epc的第83章)的任何产品、制备产品的方法或使用产品的方法,因此申请人有权并且在此公开任何先前所述产品、制备产品的方法或使用产品的方法的免责声明。
这些及其他实施方案公开于以下详述中或自以下详述为明显的并且包括于以下详述中。
附图简述
以举例方式给出,但并不意欲将本发明仅限制于描述的特定实施方案的以下详述可与附图结合而最佳地理解,其中:
图1呈现用于产生表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)次要病毒包膜蛋白的四种不同重组病毒载体的插入序列的图。vad3042表达不具有e的经密码子优化的prrsvgp2、gp3和gp4(a);vad3038表达不具有e的经密码子优化的重新靶向(“rtg”)的rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4(b);vad3041表达具有e的经密码子优化的gp2、gp3、gp4(c);vad3067表达具有e的经密码子优化的rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4(d);vad3046表达经密码子优化的猪流感病毒血球凝集素(siv-ha)(e);vad3069表达经密码子优化的核蛋白(np或n)、m、gp5和gp5a(f);和vad3064表达经密码子优化的rtg-m、rtg-gp5和rtg-gp5a(g);
图2为展示prrsv“主要”和“次要”蛋白在病毒膜的表面上的布置的示意图;
图3为展示prrsv“次要”蛋白的布置和相互作用的示意图,如当前和所公开证据指示这些蛋白理解为与宿主细胞表面受体(例如cd163)相互作用;
图4为展示插入在vad3041通道3(a)和vad3042通道3(b)中的prrsv次要蛋白的区域的pcr扩增子的凝胶图像;
图5a呈现用于使prrsv包膜蛋白重新靶向细胞表面的流程;
图5b-5d呈现rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4蛋白的图,其中内源性tm和ct结构域已被水疱性口炎病毒-g(vsv-g)跨膜(tm)和细胞质尾(ct)结构域置换,已置换信号序列,已添加表位标记,并且已插入接头序列;
图6呈现已被表位标记的rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4蛋白转染的经固定的hek293t细胞的免疫荧光分析(ifa)图像;
图7展示来自用编码各个重新靶向的包膜蛋白中的每一个的质粒转染的hek293t细胞的免疫共沉淀(co-ip)裂解物的抗vsvg蛋白印迹(wb);
图8展示来自用编码各个重新靶向的包膜蛋白或猪cd16中的每一个的质粒转染的hek293t细胞的co-ip裂解物的数个wb。ip:α-vsv,wb:α-vsv-hrp(a),ip:α-vsv,wb:α-cd163(b);ip:α-cd163,wb:α-cd163-生物素(c);
图9a至9c呈现感染有vad3038(含有经密码子优化的rtg-gp234)的hek293细胞的双重免疫荧光分析(ifa)图像;并且用对所标示的蛋白具有特异性的两种抗体和不同荧光团标记同时染色。图像通过使用特异于每一荧光团的滤光器获自相同光场。相应的图像用箭头展示;
图10为详述在整个研究中所收集的样品和收集时间的图表;
图11为展示肺损伤分数在不同组中的分布的图。vad3042(表达经密码子优化的、野生型gp2、野生型gp3和野生型gp4的ad5);vad3041(表达经密码子优化的、野生型gp2、野生型gp3、野生型gp4和野生型e的ad5);vad3038(表达经密码子优化的、rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4的ad5);和vad3033(表达猪流感病毒(siv)的经密码子优化的血球凝集素(ha)基因的ad5,阴性对照)。中位数(交叉条)和平均值(+)和方框表示第1与第3四分位数间范围之间的范围。灰色圆圈指示每一组中每一个别动物的实际肺分数;
图12列出并且描述序列表中呈现的序列;
图13为seqidno:34-39中所示的gp2多肽序列的clustalw比对;
图14为seqidno:40-45中所示的gp3多肽序列的clustalw比对;
图15为seqidno:46-51中所示的gp4多肽序列的clustalw比对;
图16为seqidno:52-58中所示的e多肽序列的clustalw比对;
图17为seqidno:62-65中所示的gp5a多肽序列的clustalw比对;
图18为展示施用vad3038(gp234-rtrg+经杀死的疫苗)或vad3046(siv-ha)的猪的肺损伤分数的图;
图19为展示施用vad3038(gp234-rtrg+经杀死的疫苗)或vad3046(siv-ha)的猪的血清病毒负荷的图;
图20比较在攻击之前和之后第1、2、4和5组的免疫反应。蛋白印迹用于以下各项探测:抗v5,用于观察e蛋白含量(左上);抗flag,用于检测gp3(右);和抗ha,用于观察gp4蛋白含量(左下);
图21为展示施用vad3067(im/im)随后杀死的疫苗,vad3067(in/im)随后杀死的疫苗;vad3067+vad3064(in/im)随后杀死的疫苗;或vad3046随后安慰剂的猪的肺损伤分数的图。所有经杀死的疫苗均im一次给予;
图22为施用vad3067(im/im)随后杀死的疫苗,vad3067(in/im)随后杀死的疫苗;vad3067+vad3064(in/im)随后杀死的疫苗;或vad3046和安慰剂的猪的血清病毒负荷的图。所有经杀死的疫苗均im一次给予;
图23展示经设计以探究e与重新靶向的gp4之间可能的相互作用(未观察到相互作用)的免疫沉淀研究的结果。在构建体中,flag标记连接至gp3;v5标记连接至e;ha标记连接至gp4;并且myc标记连接至gp2。wb(蛋白印迹)、ip(免疫沉淀)、s(可溶gp)和v(vsv标记的gp);
图24展示经设计以探究e与重新靶向的gp3之间可能的相互作用(未观察到相互作用)的ip研究的结果。
详述
应注意,在本发明中并且尤其在权利要求和/或段落中,术语诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”及其类似术语可具有美国专利法中赋予其的含义;例如其可意谓“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”及其类似术语;并且术语诸如“基本上组成为(consistingessentiallyof)”和“基本上由组成(consistsessentiallyof)”具有美国专利法中赋予其的含义,例如其允许不明确叙述各要素,但排除现有技术中所发现或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
除非另外解释,否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。除非上下文另外明确指示,否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。类似地,除非上下文另外明确指示,否则字语“或”意欲包括“和”。
术语“约”在本文中用于意指大致、在...范围内、粗略地或左右。当术语“约”与数值范围结合使用时,其通过向上或向下扩展所示数值的边界来调整其范围。一般而言,术语“约”在本文中用于修改数值到所陈述值上方和下方10%的偏差。在一个方面中,术语“约”意指加上或减去所使用数字的数值的20%。因此,约50%意指在45%-55%的范围内。在本文中利用终点叙述的数值范围包括范围内包含的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解,假定所有数字及其分数均由术语“约”修饰。
在本发明中,腺病毒5(ad5)或另一适合的载体用于在动物宿主中体内递送和表达所选prrsv包膜蛋白,以在动物中引发针对使用有毒性的prrsv的实验或天然攻击的安全并且有效的免疫反应。
虽然ad5用于递送本发明中的prrsv蛋白,但可使用任何其他适合的载体。举例而言,杆状病毒、痘病毒(包括禽痘病毒和金丝雀痘病毒)可以用于递送本文公开的新颖并且创造性的基因组合。在另一个实施方案中,猪巨细胞病毒(pcmv)可以用作载体,其为在整个体内组织(包括新生猪崽的鼻)中发现的疱疹病毒,其中其引起发炎(鼻炎)。
本发明由此涉及一种疫苗或免疫组合物,其可包含有效量的一种或多种工程化的ad5载体或其他适合的载体和任选药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
因此,本发明包括工程化的ad5载体或其他适合的表达prrsv包膜蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的载体,其在动物中引发免疫原性反应。prrsv蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原包括至少一种prrsv次要蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原,选自prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a和e。
如本文所使用,术语“prrsv次要多肽、抗原、表位或免疫原”系指猪繁殖与呼吸综合征病毒的任何次要多肽、抗原、表位或免疫原。目前,次要多肽或其组分包括gp2、gp3、gp4、gp5a和e蛋白,但可能存在与也可有效用于实践所公开的本发明的目前已知次要蛋白相关的其他蛋白。一般而言并且如本文所使用,术语“胞外结构域”是指延伸至细胞外空间中的膜蛋白的结构域。照此,对与给定蛋白的胞外结构域同一性百分比的任何指示不意欲包括与蛋白的非胞外结构域(包括跨膜结构域(tmd)和细胞质结构域(ctd))的比较。
“动物”意欲为哺乳动物、人类、禽类及其类似者。动物可选自由以下各项组成的组:马类动物(例如马)、犬类动物(例如狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、猫类动物(例如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大猫以及包括猎豹和山猫的其他猫类动物)、绵羊类动物(例如绵羊)、牛类动物(例如牛、母牛、水牛)、猪类动物(猪)、禽类动物(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如原猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)和鱼类动物。术语“动物”也包括所有发育阶段,包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。
在本发明中,猪科动物针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护为最重要的。然而,本文公开的概念将同样适用于其他病毒,如此处,关键的“细胞进入介导性”表面蛋白的相对较低或有限表达使得疫苗开发尤其具挑战性。因此,如本文中所公开,这样的“次要包膜蛋白”对细胞表面的重新靶向和/或伴随已广泛深远的应用于所有包膜病毒。
在一个实施方案中,ad5免疫组合物或疫苗包含一种或多种工程化的ad5载体和任选药学上或兽医学上可接受的赋形剂、佐剂、载剂或媒介物。工程化的ad5载体可包含编码prrsv次要蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸。prrsv蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原可为gp2、gp3、gp4、gp5a、e或其任何片段。
如本文所使用,术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱发特异性免疫反应的物质。抗原可包含经杀死的、减毒或活的整个生物体;生物体的子单元或部分;含有表达表位、多肽、肽、蛋白或其具有免疫原性特性的片段的插入序列的重组载体;在呈现至宿主动物时能够诱导免疫反应的核酸碎片或片段;蛋白、多肽、肽、表位、半抗原或其任何组合。或者,免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
如本文所使用,术语“免疫原性蛋白或肽”也包括在施用至宿主后,能够引起针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上为免疫活性的肽和多肽。优选地,蛋白片段使得其具有与全部、完整的天然蛋白基本上相同的免疫活性。因此,本发明的蛋白质片段包含至少一种表位或抗原决定子,或基本上由其组成,或由其组成。术语表位(也称为抗原决定子)为由免疫系统所识别的大分子的一部分并且能够诱导体液型(b细胞)和/或细胞型(t细胞)的免疫反应。
术语“免疫原性蛋白质或肽”进一步包括序列的缺失、添加和取代,只要多肽用于产生如本文所定义的免疫反应。就此而言,尤其优选取代将通常在自然界中保守,即那些在氨基酸家族内发生的取代。举例而言,氨基酸一般分成四个家族:(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。合理可预测的是,亮氨酸经异亮氨酸或缬氨酸独立置换或反过来;天冬氨酸经谷氨酸独立置换或反过来;苏氨酸经丝氨酸独立置换或反过来;或氨基酸经结构相关氨基酸的类似保守置换对生物活性将不具有显著影响。与参考分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的次要氨基酸取代的蛋白质因此在参考多肽的定义内。
术语“表位”是指由免疫系统所识别的大分子的一部分并且能够诱导体液型(b细胞)和/或细胞型(t细胞)的免疫反应。术语也可与“抗原决定子”或“抗原决定子位点”互换使用。识别相同表位的抗体可在显示一个抗体阻断另一抗体与目标抗原的结合的能力的简单免疫分析中鉴别。
组合物或疫苗的“免疫反应”为在宿主中产生对所关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常,“免疫反应”包括(但不限于)以下作用中的一或多个:产生抗体、b细胞、辅助t细胞和/或细胞毒性t细胞,特异性地针对所关注的组合物或疫苗中包括的抗原。优选地,宿主将呈现治疗性或保护性免疫反应,从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重度将降低。这样的保护将通过通常由感染宿主显示的症状的减少或缺乏、更快速恢复时间和/或感染宿主中降低的病毒效价展示。
如本文所用的术语“免疫原性”蛋白或多肽也指引发如上文所述的免疫反应的氨基酸序列。如本文所用,“免疫原性”蛋白或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位并且因此引发上文所述的免疫反应的蛋白的片段。这样的片段可使用任何数目的本领域中熟知的表位定位技术鉴别。参见例如epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,第66卷(glenne.morris编,1996)。
举例而言,线性表位可通过例如如下测定:在固体载体上并行合成大量肽,所述肽对应于蛋白分子的部分,并且使肽与抗体反应,而肽仍附接于载体。这样的技术为本领域中已知的并且描述在例如美国专利第4,708,871号;geysen等人,1984;geysen等人,1986中。类似地,通过测定氨基酸的空间构象(诸如,通过,例如,x射线结晶和二维核磁共振)常规地鉴别构象表位。参见例如epitopemappingprotocols,同上。
合成抗原也包括在定义内,例如多表位、侧接表位及其他重组或合成衍生的抗原。出于本发明的目的,免疫原性片段将通常包括分子的至少约3个氨基酸、约5个氨基酸、约10-15个氨基酸、约15-25个氨基酸或大于25个氨基酸。片段长度不存在临界上限,其可包含蛋白质序列的几乎全长,或甚至包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。
因此,表达表位的多核苷酸的最小结构为其包含编码prrsv蛋白或多肽的表位或抗原决定子的核苷酸,或基本上由其组成,或由其组成。编码总蛋白或多肽的片段的多核苷酸包含编码总蛋白或多肽的序列的最少15个核苷酸、有利地约30-45个核苷酸、并且优选约45-75个、至少57、87或150个连续或邻接核苷酸,或基本上由其组成,或由其组成。表位测定程序,诸如产生重叠肽文库(hemmer等人,1998)、pepscan(geysen等人,1984;geysen等人,1985;vanderzeer.等人,1989;geysen,1990;multipin.rtm.peptidesynthesiskitsdechiron)和算法(degroot等人,1999),可用于实践本发明,并且无需过多的实验。
“多核苷酸”为含有任何组合形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物的任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可具有三维结构,并且可执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括双链、单链和三链螺旋分子。除非另外指明或需要,否则作为多核苷酸的本文所述的本发明的任何实施方案包括dna、rna或杂合分子的双链形式和已知或预测会构成其双链形式的两种互补形式中的每一个。
术语“密码子优化”是指最佳配置编码蛋白、多肽、抗原、表位、结构域或片段的核酸序列以用于在所选宿主中表达/翻译的方法。一般而言,基因表达水平取决于许多因素,诸如启动子序列和调控组件。最重要的因素之一为将转录物基因的密码子使用调适成宿主的典型密码子使用(lithwich,g.andmargalit,h.,genomeres.13,2665-2673,2003)。因此,在翻译选择下原核基因组中高度表达的基因具有明显的密码子使用偏好。这是因为其使用由最丰富trna种类所识别的密码子的小型子集(ikemura,t.,j.mol.biol.151,389-409,1981)。调节此密码子调适的力被称为翻译选择并且其强度在快速生长细菌中很重要(rocha,e.p.,genomeres.14,2279-2286,2004;sharp,p.m.等人,nucleicacidsres.33,1141-1153)。若基因含有很少被宿主使用的密码子,则其表达水平将不为最大。此可为异源蛋白表达(gustafsson,c.等人,trendsbiotechnol.22,346-353,2004)和开发dna疫苗(ivory,c.和chadee,k.,genet.vaccinesther.2,17,2004)的限制之一。大量合成基因已被重新设计以增加其表达水平。合成基因数据库(sgdb)(wu,g.等人,nucleicacidsres.35,d76-d79,2007)含有来自关于合成基因的超过200次公开实验的信息。在将插入至新宿主中以按最佳量表达某些蛋白的核酸序列的设计方法中,密码子使用优化通常为最初步骤中的一个(gustafsson,c.,trendsbiotechnol.22,346-353,2004)。密码子使用优化基本上涉及改变目标基因中的罕见密码子,使得其更紧密地反映宿主的密码子使用,并且不改变所编码蛋白的氨基酸序列(gustafsson,c.,trendsbiotechnol.22,346-353,2004)。因此,通常用于优化程序的信息为待优化的dna或蛋白序列和宿主的密码子使用表(参考集)。
存在允许几种由任何本领域技术人员优化密码子的数个公共网页服务器和单机应用程序。“genedesign”(richardson,s.m.等人,genomeres.16,550-556,2006)、“syntheticgenedesigner”(wu,g.等人,proteinexpr.purif.47,441-445,2006)和“genedesigner”(villalobos,a.等人,bmcbioinformatics7,285,2006)为提供用于合成基因设计的平台(包括密码子优化步骤)的套件。关于可用于每一种服务器或程序的密码子使用优化的方法,最初开发的程序仅使用“一种氨基酸-一种密码子”方法。最新的程序和服务器现包括用于形成一些密码子使用变异性的其他方法。此变异性反映天然高度表达的基因的密码子使用变异性并且允许待引入优化程序中的其他准则(诸如避免限制性位点)。本文所述的大部分应用程序和网页服务器提供三种密码子优化方法:所有密码子的全部优化,基于使用蒙特卡洛(montecarlo)方法的参考集的相对密码子使用频率的优化,以及经设计以使优化最大化并且查询与经优化序列之间变化最少的新颖方法。
在一个实施方案中,编码重组prrsv次要蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位的核酸序列为经优化以用于在动物中表达的密码子。在另一个实施方案中,密码子优化的序列编码猪prrsv次要包膜蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位以用于动物表达。在另一个实施方案中,密码子优化的序列编码prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位以用于动物表达。
以下为多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段、外显子、内含子、mrna、trna、rrna、sirna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离dna、任何序列的经分离rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团,诸如氟核糖和硫醇盐,和核苷酸分支。核苷酸的序列可在聚合之后经进一步修饰,诸如通过与标记组分缀合。包括于此定义中的其他类型的修饰为caps,通过类似物取代天然存在的核苷酸中的一个或多个,和引入将多核苷酸连接至蛋白、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体载体的方法。多核苷酸可通过化学合成获得或衍生自微生物。
术语“基因”广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任何区段。因此,基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中的),或仅包括编码序列(如对于其表达所需的cdna和/或调节序列中)。举例而言,基因也指表达mrna或功能rna,或编码特定蛋白质,并且包括调节序列的核酸片段。
本发明进一步包含编码prrsv次要包膜蛋白、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合的并且具有任何长度,并且可含有任何组合形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为直链或分支链的,其可包含经修饰氨基酸或氨基酸类似物,并且其可杂有除氨基酸以外的化学部分。术语也包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰,诸如与标记或生物活性组分缀合。
“经分离”多核苷酸或多肽为“基本上不含”其天然环境中相关的物质的多核苷酸或多肽。“基本上不含”意指多核苷酸或多肽至少50%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%不含这些物质。若“经分离”多核苷酸或多肽称为“几乎完全不含污染物”,则其意指经分离多核苷酸或多肽至少98%不含这些物质。
本发明进一步包括多核苷酸,其编码prrsv多肽的功能等效变体和衍生物及其功能等效片段,其可增强、减弱或不显著影响由此编码的多肽的固有特性。这些功能等效变体、衍生物和片段展示保留活性的能力。举例而言,并不改变所编码的氨基酸序列的dna序列变化、以及引起氨基酸残基的保守取代、一个或几个氨基酸缺失或添加和氨基酸残基经氨基酸类似物取代的dna序列变化将不显著影响所编码的多肽的特性。在一个实施方案中,变体具有与所关注的prrsv多核苷酸或多肽至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源性或同一性。
在一个方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsv次要包膜多肽。在另一方面中,本发明提供一种多肽,其具有seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列或其变体或片段。
在另一方面中,本发明提供一种多肽,其具有与本发明的prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽、尤其与具有seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽(seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139)的片段和变体,其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列或其变体的prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽的片段包括在全长prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽上发现的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供具有seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的核苷酸序列或其变体的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供与具有seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列或其变体的多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多核苷酸。
在一个方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsve多肽。在另一方面中,本发明提供具有seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中,本发明提供与本发明的prrsve多肽、尤其与具有seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsve多肽(seqidno:7、20、52-58或130-139)的片段和变体,其可由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术常规制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsve多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的序列或其变体的prrsve多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsve多肽的片段包括在全长prrsve多肽上发现的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsve多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsve多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsvgp2多肽。在另一方面中,本发明提供具有seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中,本发明提供与本发明的prrsvgp2多肽、尤其与具有seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsvgp2多肽(seqidno:1、14、34-39或80-89)的片段和变体,其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsvgp2多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的序列或其变体的prrsvgp2多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsvgp2多肽的片段包括发现于全长prrsvgp2多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsvgp2多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsvgp2多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsvgp3多肽。在另一方面中,本发明提供具有seqidno:3、16或40-45中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中,本发明提供与本发明的prrsvgp3多肽、尤其与具有seqidno:3、16或40-45中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsvgp3多肽(seqidno:3、16或40-45)的片段和变体,其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:3、16或40-45中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsvgp3多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:3、16或40-45中所示的序列或其变体的prrsvgp3多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsvgp3多肽的片段包括发现于全长prrsvgp3多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsvgp3多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:3、16或40-45中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:3、16或40-45中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsvgp3多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsvgp4多肽。在另一方面中,本发明提供具有seqidno:5、18或46-51中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中,本发明提供与本发明的prrsvgp4多肽、尤其与具有seqidno:5、18或46-51中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsvgp4多肽(seqidno:5、18或46-51)的片段和变体,其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:5、18或46-51中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsvgp4多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:5、18或46-51中所示的序列或其变体的prrsvgp4多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsvgp4多肽的片段包括发现于全长prrsvgp4多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsvgp4多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:5、18或46-51中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:5、18或46-51中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsvgp4多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供prrsv多肽,尤其prrsvgp5a多肽。在另一方面中,本发明提供具有seqidno:31或62-65中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中,本发明提供与本发明的prrsvgp5a多肽、尤其与具有seqidno:31或62-65中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽。
在另一方面中,本发明提供上述经鉴别的prrsvgp5a多肽(seqidno:31或62-65)的片段和变体,其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与seqidno:31或62-65中所示的氨基酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的同源多肽。
prrsvgp5a多肽的免疫原性片段包括具有seqidno:31或62-65中所示的序列或其变体的prrsvgp5a多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中,prrsvgp5a多肽的片段包括发现于全长prrsvgp5a多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中,本发明提供编码prrsvgp5a多肽的多核苷酸,诸如编码具有seqidno:31或62-65中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供编码与具有seqidno:31或62-65中所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码prrsvgp5a多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中,本发明提供具有seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的核苷酸序列或其变体的多核苷酸。在另一方面中,本发明提供与具有seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列的多核苷酸中的一个或其变体具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中,本发明提供一种安全并且有效的免疫或疫苗组合物,其包含:一种或多种重组病毒载体,其包含一种或多种异源多核苷酸,其编码一种或多种猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e抗原、多肽、胞外结构域或其变体;和药学上或兽医学上可接受的载体。“其变体”意欲包括抗原、多肽和胞外结构域(包括例如,如本文中所公开的蛋白的重新靶向的变体)的免疫等效形式。“免疫等效”意指如与初始比较抗原、多肽或胞外结构域相比,“其变体”能够引发基本上类似的免疫反应,包括保护性免疫反应。
在组合物的一些实施方案中,一种或多种载体包含重组腺病毒5prrsv(ad5-prrsv)载体、重组杆状病毒prrsv载体、重组猪巨细胞病毒prrsv载体或重组痘病毒prrsv载体。
在一些实施方案中,一种或多种载体包含:编码prrsve抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列;或编码经修饰的prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或m抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列,其中gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或m的现有细胞定位序列已被来自异源基因的细胞表面表达决定子序列置换。在一些实施方案中,一种或多种载体包含两种载体的混合物,即表达重新靶向的prrsv次要蛋白的第一载体和表达重新靶向的prrsv主要蛋白的第二载体。
在一些实施方案中,重组载体包含编码具有以下特征的抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸:与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中的任何一个或多个至少90%的序列同一性;或与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,重组ad5-prrsv载体包含具有以下特征的多核苷酸:与seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78至少90%的序列同一性;或与由seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列编码的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,组合物或疫苗包含一种或两种ad5-prrsv载体。在一些实施方案中,ad5-prrsv可表达gp2和e;gp2、gp4和e;gp2、gp3、gp4和e;rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4;rtg-gp2和e;rtg-gp2、rtg-gp4和e;rtg-gp3和e;rtg-gp4和e;单独e;单独rtg-e;rtg-gp5、rtg-m。
在一些实施方案中,ad5-prrsv重组载体包含编码与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139具有至少90%的序列同一性的抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸;或包含编码与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域具有至少90%的序列同一性的胞外结构域的多核苷酸。
在一些实施方案中,重组ad5-prrsv载体包含具有以下特征的多核苷酸:与seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78至少90%的序列同一性;或包含与由seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列编码的胞外结构域序列具有至少90%同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中,重组ad5-prrsv载体包含编码一种或多种prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或e抗原、多肽、胞外结构域、或其变体或其组合的一种或多种多核苷酸。
在一些实施方案中,重组ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的一种或多种抗原、多肽或胞外结构域的一种或多种多核苷酸:(a)与seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列至少90%的序列同一性;或(b)与由seqidno:1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列包括的胞外结构域至少90%的序列同一性。“由...包括的胞外结构域”意欲仅给定seqidno的细胞外部分(即,并非跨膜或细胞质部分)经受序列同一性百分比限制。举例而言,若由200个氨基酸组成的多肽具有跨氨基酸编号20至100的胞外结构域,则比较多肽仅需要跨氨基酸编号20至100具有90%同一性(即在90%的序列同一性措辞的情况下)。现本发明已公开,申请人设想本领域技术人员可常规地自多种tmd和ctd选择以与所公开的保护性prrsv多肽的个体和组合的胞外结构域组合。
在一些实施方案中,一种或多种多核苷酸与seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列具有至少90%的序列同一性;或,多核苷酸跨由seqidno:2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列中所示的序列编码的胞外结构域长度具有至少90%的序列同一性。使用常规技术的本领域技术人员可了解或确认哪些多核苷酸序列编码胞外结构域。
在一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的prrsvgp2多肽的多核苷酸:(a)与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列至少90%的序列同一性;或(b)与seqidno:1、14、34-39或80-89的子序列中所示的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的prrsve多肽的多核苷酸:(a)与seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列至少90%的序列同一性;或(b)与seqidno:7、20、52-58或130-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的prrsvgp3多肽的多核苷酸:(a)与seqidno:5、18、40-45或90-99(gp3蛋白)中所示的序列至少90%的序列同一性;或(b)与seqidno:5、18、40-45或90-99的子序列中所示的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的prrsvgp2和e多肽的两种多核苷酸:(a)与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个和seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列中的一个至少90%的序列同一性;或(b)与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列和seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的prrsvgp2、e和gp4多肽的多核苷酸:(a)与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列中的一个和seqidno:5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90%的序列同一性;或(b)与由seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域、由seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域和由seqidno:5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域至少90%的序列同一性。
在另一方面中,本发明提供一种在有需要的动物中引发针对prrsv的保护性免疫反应的方法,其包括向动物施用表达至少一种gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或eprrsv抗原的重组ad5-prrsv载体和药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
在方法的一些实施方案中,ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸:(a)与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)和seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列中的一个至少90%的序列同一性;或(b)与由相应前述seqidno包括的gp2蛋白或e蛋白胞外结构域至少90%的序列同一性。
如权利要求24的方法,其中ad5-prrsv载体包含编码具有以下特征的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸:与seqidno:1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、seqidno:7、20、52-58或130-139(e蛋白)中所示的序列中的一个和seqidno:5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90%的序列同一性;或(b)与由相应前述seqidno包括的gp2、e和gp3胞外结构域至少90%的序列同一性。
在一些实施方案中,施用是通过经口鼻、喷雾剂、饮用水、肌肉内、或皮下施用、皮内、经皮进行。在一些实施方案中,施用为初免-加强。在一些实施方案中,第一接种为两种ad5载体的混合物,即,表达重新靶向的prrsv次要蛋白的第一载体和表达prrsv主要蛋白的第二载体;并且加强包含第一接种的两种载体或任一单独载体,或基本上由其组成。在一些实施方案中,需要保护的动物为猪动物。
一般而言,氨基酸序列的比较通过将已知结构的多肽的氨基酸序列与未知结构的多肽的氨基酸序列比对来实现。接着,比较序列中的氨基酸,并且将同源氨基酸的群分组在一起。此方法检测多肽的保守区并且考虑氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用市售算法测定(也参见上述同源性的描述)。除了本文中另外提及的那些以外,提及程序blast、空隙blast、blastn、blastp和psi-blast,其由国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)提供。这些程序在本领域中广泛用于此目的并且可比对两个氨基酸序列的同源区。
或者或另外,举例而言,相对于核苷酸或氨基酸序列,术语“同源性”或“同一性”可指示两个序列之间的同源性的定量量度。序列同一性百分比可计算为(nref-ndif)*100/nref,其中ndif为在比对时两个序列中的非相同残基总数,并且其中nref为序列中的一个中的残基数目。因此,dna序列agtcagtc将与序列aatcaatc具有75%的序列同一性(nref=8;ndif=2)。
或者或另外,相对于序列,“同源性”或“同一性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中的较短者中的核苷酸或氨基酸数目,其中两个序列的比对可根据威尔伯和利普曼算法(wilbur和lipmanalgorithm,wilbur等人,1983)测定,例如使用20个核苷酸的窗口大小,4个核苷酸的字组长度和4的空隙罚分,并且计算机辅助分析和包括比对的序列数据的解释可使用市售程序(例如vectorntisoftwaretm,invitrogeninc.ca,usa)方便地执行。当rna序列称为与dna序列类似或与dna序列具有一定程度的序列同一性或同源性时,dna序列中的胸苷(t)视为与rna序列中的尿嘧啶(u)等同。因此,通过将dna序列中的胸苷(t)视为与rna序列中的尿嘧啶(u)等同,rna序列在本发明的范畴内并且可衍生自dna序列。并且,在无需过度实验的情况下,本领域技术人员可查询许多其他程序或参考文献以用于测定同源性百分比。
本发明另外包括含于载体分子或表达载体中并且可操作地连接于启动子组件并且任选连接于增强子的prrsv多核苷酸。
“载体”是指包含待在体外或体内递送至靶标细胞的异源多核苷酸的重组dna或rna质粒、噬菌体或病毒。出于预防或疗法的目的,异源多核苷酸可包含所关注的序列,并且可任选呈表达盒形式。如本文所用,载体不必能够在最终的靶标细胞或个体中复制。术语“载体”包括用于克隆的载体以及病毒载体。
术语“工程化”或“重组”意指多核苷酸半合成或合成来源,其不存在于自然界中或以未发现于自然界中的布置连接至另一多核苷酸。
“异源”意指衍生自与其所比较的实体的其余部分遗传上不同的实体。举例而言,多核苷酸可通过基因工程化技术并入至衍生自不同来源的质粒或载体中,并且由此为异源多核苷酸。自天然编码序列移除并且可操作地连接于除天然序列以外的编码序列的启动子为异源启动子。
本发明的多核苷酸可包含额外序列,诸如相同转录单元内的额外编码序列;控制组件,诸如启动子;核糖体结合位点;5’utr;3’utr;转录终止子;聚腺苷酸化位点;相同或不同启动子控制下的额外转录单元;允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列;和提供本发明的实施方案可能需要的任何这样的构建体。
用于prrsv多肽、抗原、表位或免疫原的表达的组件有利地存在于本发明载体中。以最小的方式,此包含起始密码子(atg)、终止密码子和启动子和此外任选某些载体(诸如质粒和某些病毒载体)的聚腺苷酸化序列,基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多肽片段,例如prrsv肽,有利地在载体中时,atg放置在阅读框架的5’处并且终止密码子放置在3’处。可存在控制表达的其他组件,诸如增强子序列、稳定序列,诸如内含子和/或非翻译的5’或3’序列以及允许蛋白分泌的信号序列。
制造和/或施用用于在体内或体外表达本发明的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可为任何所需方法,例如利用或类似于以下各项中引用的文件中公开的方法的方法:美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第4,394,448号、第4,722,848号、第4,745,051号、第4,769,331号、第4,945,050号、第5,494,807号、第5,514,375号、第5,744,140号、第5,744,141号、第5,756,103号、第5,762,938号、第5,766,599号、第5,990,091号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第5,591,639号、第5,589,466号、第5,677,178号、第5,591,439号、第5,552,143号、第5,580,859号、第6,130,066号、第6,004,777号、第6,130,066号、第6,497,883号、第6,464,984号、第6,451,770号、第6,391,314号、第6,387,376号、第6,376,473号、第6,368,603号、第6,348,196号、第6,306,400号、第6,228,846号、第6,221,362号、第6,217,883号、第6,207,166号、第6,207,165号、第6,159,477号、第6,153,199号、第6,090,393号、第6,074,649号、第6,045,803号、第6,033,670号、第6,485,729号、第6,103,526号、第6,224,882号、第6,312,682号、第6,348,450号、第6,312,683号和第6,596,279号;美国专利申请第12/753,597号;wo90/01543;w091/11525;wo94/16716;wo96/39491;wo98/33510;ep265785;ep0370573。
本发明还涉及包含载体、诸如表达载体的组合物或疫苗。组合物或疫苗可包含一种或多种载体(例如表达载体,诸如体内表达载体),基本上由其组成或由其组成,所述载体包含prrsv多肽、抗原、表位或免疫原中的一个或多个,基本上由其组成或由其组成(或表达其)。在药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物中,载体含有并且表达多核苷酸,所述多核苷酸包含编码(或表达)prrsv抗原、表位或免疫原的多核苷酸,基本上由其组成或由其组成。
根据另一个实施方案,组合物或疫苗中的载体包含编码一种或多种蛋白或其片段(prrsv多肽、抗原、表位或免疫原)的多核苷酸,或基本上由其组成或由其组成。本发明组合物或疫苗包含一种或多种载体,基本上由其组成或由其组成,所述载体包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成并且有利地也在体内在适当条件或适合的条件下或在适合的宿主细胞中表达以下各项:编码相同蛋白和/或不同蛋白的来自不同prrsv分离株的多核苷酸。
术语质粒包括包含本发明的多核苷酸及其在所需宿主或目标的细胞中体内表达必需的组件的任何dna转录单元;并且就此而言,应注意,超螺旋质粒及其拓扑异构体、开环质粒以及质粒的线性形式中的全部均意欲在本发明的范畴内。
除编码重组蛋白、抗原、表位或免疫原的异源多核苷酸以外,各质粒包含或含有编码异源肽序列、变体、类似物或片段的多核苷酸或基本上由其组成,任选与其融合,可操作地连接于启动子或在启动子的控制下或依赖于启动子。一般而言,采用在真核细胞中功能性的强启动子为有利的。优选的强启动子为人类或鼠类来源的即刻早期巨细胞病毒启动子(cmv-ie),或任选具有另一来源,诸如大鼠或豚鼠。cmv-ie启动子可包含实际启动子区段,其可或可不与增强子区段结合。可参考ep-a-260148、ep-a-323597、美国专利第5,168,062号、第5,385,839号和第4,968,615号以及pct申请第wo87/03905号。cmv-ie启动子有利地为人类cmv-ie(boshart等人,1985)或鼠类cmv-ie。
更一般而言,启动子具有病毒或细胞来源。可有用地用于本发明的实践中的除cmv-ie以外的强病毒启动子为sv40病毒的早期/晚期启动子或劳斯(rous)肉瘤病毒的ltr启动子。可有效用于本发明的实践中的强细胞启动子为细胞骨架的基因的启动子,诸如结蛋白启动子(kwissa等人,2000)或肌动蛋白启动子(miyazaki等人,1989)。
这些启动子的功能子片段(即,这些启动子中维持足够促进活性的部分)包括在本发明内,例如根据pct申请第wo98/00166号或美国专利第6,156,567号的截短cmv-ie启动子。本发明的实践中的启动子因此包括维持足够促进活性的全长启动子的衍生物和子片段并且因此充当启动子,优选地,促进活性与衍生物或子片段所衍生自的实际或全长启动子的活性基本上相似,例如与美国专利第6,156,567号的截短cmv-ie启动子活性、与全长cmv-ie启动子的活性类似。由此,本发明的实践中的cmv-ie启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分以及衍生物和子片段,或基本上由其组成或由其组成。
优选地,质粒包含其他表达控制组件或基本上由其组成。尤其有利的为,并入稳定序列,例如内含子序列,优选地,hcmv-ie的第一内含子(pct申请第wo89/01036号)、兔β-球蛋白基因的内含子ii(vanooyen等人,1979)。
至于除痘病毒以外的质粒和病毒载体的聚腺苷酸化信号(polya),可更多使用牛生长激素(bgh)基因的聚(a)信号(参见美国专利第5,122,458号)或兔β-球蛋白基因的聚(a)信号或sv40病毒的聚(a)信号。
根据本发明的另一个实施方案,表达载体为用于蛋白在适当细胞系统中体外表达的表达载体。在分泌之后或不在分泌之后(若不存在分泌,细胞裂解典型地发生或得以执行),任选通过浓缩方法(诸如超滤)浓缩和/或通过纯化手段(诸如亲和力、离子交换或凝胶过滤型层析方法)纯化,可在培养物上清液中或自培养物上清液收集所表达蛋白。
“宿主细胞”指示已遗传改变,或能够通过施用外源多核苷酸,诸如重组质粒或载体遗传改变的原核或真核细胞。当指遗传改变细胞时,术语是指初始改变细胞及其后代两者。宿主细胞包括(但不限于)幼仓鼠肾(bhk)细胞、结肠癌(caco-2)细胞、cos7细胞、hek293细胞、mcf-7细胞、mcf-10a细胞、马丁-达比犬肾(madin-darbycaninekidney,mdck)细胞系、貂肺(mv1lu)细胞、mrc-5细胞、u937细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、猴vero细胞(具有非洲绿猴肾脏来源的细胞系)、鹌鹑(鹌鹑肌肉细胞系qm7)、鸡细胞系df1和vero细胞。包含所需序列的多核苷酸可插入至适合的克隆或表达载体中,并且载体又可引入至适合的宿主细胞中以用于复制和扩增。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方式引入至宿主细胞中。含有所关注的多核苷酸的载体可通过许多适当方式中的任一个引入至宿主细胞中,包括直接摄取、内饮作用、转染、f配对、电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其他物质的转染;微弹轰击;脂质体转染;和感染(其中载体为感染性的,例如逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择将常常视宿主细胞的特征而定。
在本发明的一个实施方案中,载体为如us2010/0255029(以全文引用的方式并入本文中)中所述的ad5载体。
基于ad5载体的prrsv疫苗的优点包括(但不限于)(1)诱导广泛免疫性,包括体液、细胞和黏膜反应;(2)并不表达所有prrsv蛋白,并且因此与diva(在经感染与经接种动物之间进行区分)策略兼容;(3)诱导免疫性的快速起效;和(4)在偶然释放的情况下与灭活疫苗相比,生产对环境造成的风险较小。
本发明的一个方面涉及表达prrsv抗原的工程化或重组ad5载体。抗原可为prrsv次要包膜蛋白,诸如上述gp2、gp3、gp4、gp5a或e蛋白。工程化ad5载体可包含编码一种或多种prrsv抗原的一种或多种多核苷酸。在另一方面中,工程化ad5载体包含一种或多种多核苷酸,一种或多种多核苷酸编码prrsvgp2抗原或其变体、prrsve抗原或其变体、prrsvgp3抗原或其变体、prrsv抗原或其变体、gp4抗原或其变体或其组合。
在一个实施方案中,本发明提供施用治疗有效量的制剂以用于在靶标细胞中递送和表达蛋白、抗原表位或免疫原。预防或治疗有效量的测定对于本领域技术人员为常规实验。在另一个实施方案中,制剂包含表达载体,表达载体包含表达prrsv次要包膜抗原、表位或免疫原的多核苷酸;和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物、佐剂或赋形剂。在另一个实施方案中,药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物、佐剂或赋形剂有助于转染和/或改良载体或蛋白的保存。
药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂已为本领域技术人员所熟知。举例而言,药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂可为无菌水、0.9%nacl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂包括(但不限于)聚-(l-谷氨酸)或聚乙烯吡咯啶酮。药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂可为任何促进载体(或体外表达自本发明载体的蛋白)施用的化合物或化合物组合;有利地,载剂、媒介物或佐剂或赋形剂可促进转染和/或改良载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中论述于一般描述中并且也可由本领域技术人员自本发明阅读以及本领域中的知识而在无任何过度实验的情况下确定。
非排他地适用于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质为具有下式的那些:
其中r1为具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基团,r2为含有2或3个碳原子的另一脂族基团,并且x为氨基或羟基,例如dmrie。在另一个实施方案中,阳离子脂质可与中性脂质,例如dope缔合。
在这些阳离子脂质中,优选为dmrie(n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵;wo96/34109),有利地与中性脂质,有利地dope(二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺;behr,1994)缔合以形成dmrie-dope。
与佐剂的质粒混合物即时地和/或与施用制剂同时或在施用制剂之前不久形成;例如在施用之前不久形成质粒-佐剂混合物,有利地以便给予足够施用前时间以使得混合物形成复合物,例如施用之前约10与约60分钟之间,诸如施用之前大致30分钟。
当dope存在时,dmrie:dope摩尔比可为约95:约5至约5:约95,或约1:约1,例如1:1。dmrie或dmrie-dope佐剂:质粒重量比可为约50:约1至约1:约10,诸如约10:约1至约1:约5,和有利地约1:约1至约1:约2,例如1:1至1:2。
在另一个实施方案中,药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物可为油包水乳液。适合的油包水乳液的实例包括油基油包水疫苗乳液,其在4℃下稳定并且为流体,含有:6至50v/v%,优选12至25v/v%含抗原水相,总计或部分含有非可代谢油(例如矿物油,诸如石蜡油)和/或可代谢油(例如植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的50至94v/v%油相,0.2至20p/v%,优选3至8p/v%表面活性剂,后者为总计或部分的,或在聚甘油酯(所述聚甘油酯优选为聚丙三醇(聚)蓖麻酸酯)或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氢化聚氧乙烯蓖麻毒素油的混合物中。可用于油包水乳液中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(tween
本发明的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由其组成。用于本发明的实践中的适合的佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,顺丁烯二酸酐和烯基衍生物聚合物,(2)免疫刺激序列(iss),诸如具有一个或多个非甲基化cpg单元的寡脱氧核苷酸序列(klinman等人,1996;wo98/16247),(3)水包油乳液,诸如m.powell,m.newman,plenumpress1995出版的“vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach”的第147页上描述的spt乳液,和相同作品的第183页上描述的乳液mf59,(4)含有季铵盐的阳离子脂质,例如dda,(5)细胞因子,(6)氢氧化铝或磷酸铝,(7)皂素或(8)所引用和以引用的方式并入本申请中的任何文献中论述的其他佐剂,或(9)其任何组合或混合物。
尤其适合于病毒载体的水包油乳液(3)可基于:轻液体石蜡油(欧洲药典型);类异戊二烯油,诸如角鲨烷、角鲨烯;产生于烯烃的寡聚的油,例如异丁烯或癸烯;具有直链烷基的酸或醇的酯,诸如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯;或分支链、脂肪醇或酸的酯,尤其异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可为非离子表面活性剂,诸如:一方面,脱水山梨糖醇、甘露糖醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚丙三醇或丙二醇和另一方面,油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯,所述酯任选经乙氧基化,或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段,诸如pluronic,例如l121。
在类型(1)佐剂聚合物中,优选为交联丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,尤其通过糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物以名称carbomer已知(pharmeuropa,第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利第2,909,462号,其提供通过具有至少三个羟基,优选不超过八个这样的基团的聚羟基化合物交联的这样的丙烯酸聚合物,至少三个羟基的氢原子经具有至少两个碳原子的不饱和脂族基团置换。优选基团为含有2至4个碳原子的那些基团,例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。不饱和基团也可含有其他取代基,诸如甲基。以名称carbopol销售的产品(bfgoodrich,ohio,usa)尤其适合。其通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基异戊四醇交联。其中,提及carbopol974p、934p和971p。
关于顺丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物,优选为ema(monsanto),其为直链或交联乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物并且其例如通过二乙烯醚交联。也参考j.fields等人,1960。
关于结构,丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和ema优选由具有下式的基本单元形成:
其中:
可相同或不同的r1和r2表示h或ch3
x=0或1,优选x=1
y=1或2,x+y=2。
就ema而言,x=0并且y=2并且就carbomer而言,x=y=1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/lnacl)中并且ph可调节至7.3至7.4,例如通过钠碱(naoh),以提供可并入表达载体的佐剂溶液。最终免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可在0.01至1.5%w/v、0.05至1%w/v和0.1至0.4%w/v之间的范围内。
细胞因子(5)可在免疫或疫苗组合物中呈蛋白质形式,或可与其免疫原或表位共表达于宿主中。优选为细胞因子的共表达,此通过与表达其免疫原或表位相同的载体,或通过其独立载体。
本发明包含制备这样的组合组合物;例如通过掺合活性组分,有利地掺合在一起并且与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂一起。
可用于本发明中的细胞因子包括(但不限于)粒细胞群落刺激因子(g-csf)、粒细胞/巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、干扰素α(ifnα)、干扰素β(ifnβ)、干扰素γ(ifnγ)、介白素-1α(il-1α)、介白素-1β(il-1β)、介白素-2(il-2)、介白素-3(il-3)、介白素-4(il-4)、介白素-5(il-5)、介白素-6(il-6)、介白素-7(il-7)、介白素-8(il-8)、介白素-9(il-9)、介白素-10(il-10)、介白素-11(il-11)、介白素-12(il-12)、肿瘤坏死因子α(tnfα)、肿瘤坏死因子β(tnfβ)和转化生长因子β(tgfβ)。应理解,细胞因子可与本发明的免疫或疫苗组合物共施用和/或依序施用。因此,举例而言,本发明的疫苗也可含有体内表达适合的细胞因子的外源性核酸分子,例如与待接种或在其中引发免疫反应的此宿主匹配的细胞因子(例如用于待向猫类动物施用的制剂的猫类动物细胞因子)。
在另一个实施方案中,本发明的组合物可使用如由stauffer等人(recentpatentsonanti-infectivedrugdiscovery,1,291-296,2006)所述的化学品或物理程序制备。一些灭活技术概述在下表中。
表1:灭活技术
本发明的免疫组合物和/或疫苗包含有效引发保护或治疗反应的量的一种或多种如本文所论述的表达载体和/或多肽或基本上由其组成或由其组成;并且有效量可在无过度实验的情况下自本发明测定,包括并入本文中的文件和在本领域中的知识。
本发明的组合物或疫苗可经由饮用水、经口鼻、喷雾剂、气雾剂、鼻内滴注、经皮、皮下或肌肉内注射施用至动物。有利地,疫苗通过经皮、经口鼻、皮下、肌肉内、喷雾剂或饮用水施用。
本发明包括至少一次向动物施用有效量的根据本发明制得的治疗组合物。本发明的治疗组合物可通过无针设备(如通过pigjet、dermojet、biojector、vetjet或vitajet设备(bioject,oregon,usa))施用。
在本发明的一个实施方案中,可采用初免-加强(prime-boost)方案,其包括使用至少一种常用蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初步施用和至少一次加强施用。用于初步施用的免疫组合物或疫苗与用作加强施用的那些在性质上不同。然而,应注意,相同组合物可用作初免施用和加强施用。此施用方案称作“初免-加强”。
在本发明的初免-加强方案的另一方面中,施用包含工程化ad5prrsv疫苗或组合物的组合物,随后施用包含含有并且在体内表达prrsv抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物、或包含prrsv抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含prrsv子单元(蛋白)的疫苗或组合物、或含有或表达prrsv抗原的dna质粒疫苗或组合物。同样地,初免-加强方案可包含施用包含含有并且在体内表达prrsv抗原的重组病毒载体、或包含prrsv抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含prrsv子单元(蛋白)的疫苗或组合物、或含有或表达prrsv抗原的dna质粒疫苗或组合物,随后施用包含工程化ad5prrsv疫苗或组合物的组合物。应注意,初步和二次给药均可包含含工程化ad5prrsv疫苗或组合物的组合物。另外注意,初步和二次给药均可包含含本发明的工程化载体的一种或多种组合物。
初免-加强方案包含使用至少一种常见抗原的至少一次初免-施用和至少一次加强施用。用于初免-施用的疫苗或组合物可与用作稍后加强疫苗或组合物的那些在性质上不同。初免-施用可包含一次或多次施用。类似地,加强施用可包含一次或多次施用。
各种施用优选相隔约1至约6周、或相隔约2至约4周进行。也包括每2至6周重复加强或每年加强。在首次施用时,动物年龄优选为至少一天。
免疫组合物和/或疫苗每剂量含有约104至约1011个、有利地约105至约1010个并且更有利地约106至约109个表达prrsv抗原、表位或免疫原的重组腺病毒的病毒粒子。在基于痘病毒的免疫组合物和/或疫苗的情况下,剂量可在约102pfu与约109pfu之间。免疫组合物和/或疫苗每剂量含有约102至约107、有利地约103至约105pfu表达prrsv抗原、表位或免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。
病毒载体可为减毒禽痘表达载体。在一个实施方案中,禽痘表达载体可为禽痘载体,例如
疫苗的功效可在通过用有毒性的prrsv病毒株攻击动物而在最后一次免疫接种之后约2至4周测试。同源和异源病毒株均可用于攻击以测试疫苗功效。动物可通过喷雾剂、经鼻内、im、气管内和/或经口攻击。视施用途径而定,在一定体积中,攻击病毒攻击可为每剂量约103至约109个病毒粒子或感染单位。举例而言,若通过喷雾剂施用,则将病毒悬浮液雾化以产生约1至200μm液滴,若施用为经鼻内、气管内或经口施用,则攻击病毒的体积为约0.05至约5ml。在攻击之后14天,可每天观察动物的临床征象和死亡率。另外,动物组可经安乐死并且针对病理性发现进行评估。攻击后可自所有动物收集口咽、气管或泄殖腔拭子以用于病毒检测。组织中存在或不存在病毒抗原可通过免疫组织化学、病毒分离或滴定或核酸检测(诸如逆转录酶聚合酶链反应(rt-pcr))来评估。血液样品可在攻击后收集并且可分析抗prrsvgp2、gp3、gp4、gp5a、e病毒特异性抗体的存在。或者,当工程化载体含有表位标记时,标记特异性抗体可以用于检测重组疫苗多肽的存在和位置。
本领域技术人员应理解,本文中的公开内容以举例方式提供并且本发明不限于此。自本文中的公开内容和本领域中的知识,本领域技术人员可在无任何过度实验的情况下确定用于各免疫接种方案的施用次数、施用途径和剂量。
本发明的另一个实施方案为一种进行诱发针对动物中的prrsv的免疫或保护反应的方法的试剂盒,其包含含重组ad5免疫组合物或疫苗或灭活prrsv免疫组合物或疫苗,和进行以有效量递送以引发动物中的免疫反应的方法的说明书。
除非另外专门叙述,否则核酸插入序列、质粒和重组病毒载体的构建使用本领域中已知的标准分子生物学技术进行,例如由j.sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,newyork,1989)描述。
尤其关于主题合格性,本文公开的载体并不在经接种动物中引起天然产生量的prrsv蛋白的表达。每一基因的表达由非天然异源启动子组件驱动,并且因此,所表达的每一同源蛋白的最终量将不等于在天然prrsv感染期间产生的量。此外,所公开的表达系统的一个重要目的为产生相对较高含量的prrsv次要包膜蛋白(天然、经修饰或工程化),和将次要蛋白恰当地呈现至宿主动物的免疫系统,在动物中引发安全并且保护性的免疫反应。天然prrsv感染典型的prrsv次要包膜蛋白的含量和呈现无法引发安全并且有效的针对prrsv次要蛋白的免疫反应。因此,所公开的疫苗组合物及其经接种动物内的最终处置当与其最接近的天然产生的对应物比较时在结构和功能方面显著不同。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1-表达prrsv基因的质粒的构建和测试
为了增加免疫系统的可视性,通过引入多种变化同时维持细胞外结构域(推定的抗体结合位点),使prrsv包膜蛋白自细胞内区室重新靶向至细胞表面。包膜基因的重新靶向最初试图通过以下方式进行:移除天然蛋白的细胞质和跨膜结构域(其为驻留信号的可能的位点),并且用来自水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)(已知用于细胞表面表达的另一病毒蛋白)的类似结构域将其置换。天然包膜基因的信号序列也用来自组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tpa,一种充分表征的分泌蛋白)的信号序列置换,以促进经修饰蛋白进入分泌路径并且最终表达在细胞表面上。特异性表位标记也插入至重新靶向的蛋白中的每一个中以追踪蛋白在细胞内的表达和易位。将侧接接头序列的表位标记myc、flag和ha分别插入至gp2、gp3和gp4中(图5a-5d)。
重新靶向的蛋白的表面表达。重新靶向的基因中的每一个以其整体合成并且克隆至具有cmv启动子的表达质粒中。质粒转染至hek293t细胞中,并且通过免疫荧光分析(ifa)在固定的细胞中检测其表达(图6)。细胞表面和总蛋白表达易于在经gp3-flag-vsv和gp4-ha-vsv转染的细胞中检测。然而,gp2-myc-vsv转染的细胞中的表达仅在细胞透化之后检测到,指示引入gp2中的修饰不足以使蛋白重新靶向细胞表面。此外,在透化后,对gp2-myc-vsv的染色与对gp3或gp4修饰(重新靶向)的蛋白的染色明显不同。在gp2-myc-vsv的情况下,染色更局部并且强烈,而在gp3-flag-vsv和gp4-ha-vsv中,其在整个细胞中扩散。此指示gp2-vsv-myc蛋白经表达,但可能不恰当地折叠,变得滞留在一些亚细胞室中。经修饰的gp2不能恰当折叠可能存在数种原因。首先,这些可为蛋白中在针对表面表达修饰的方法中移除的其他部分(诸如信号序列、跨膜或细胞质尾)恰当折叠的要求。第二,其也可归因于仍含有驻留信号的gp2结构域的不完全移除。第三,错误折叠可能已因存在myc标记(其在经修饰的gp3或gp4中不存在)而经诱导。第四,已显示,缺少次要蛋白中的一个的表达会消除所有次要蛋白并入至病毒粒子中;因此,gp2可能需要gp3和gp4的存在以获得恰当折叠。
重新靶向的蛋白相互作用以形成寡聚物。次要蛋白之间的相互作用已利用功能分析而被表明并且利用生物化学分析而直接被证明。将编码重新靶向的蛋白中的每一个的质粒共转染至hek-293t细胞中,并且次要蛋白之间的相互作用利用免疫共沉淀(co-ip)分析测试。如图7中所示,抗ha抗体特异性地向下拉动gp4-ha-vsv(泳道3)而非gp3-flag-vsv(泳道2)或gp2-myc-vsv(泳道1)。然而,当所有经修饰的蛋白共转染时,除gp4-ha-vsv以外,相同抗ha抗体向下拉动其他蛋白条带(泳道4,红点),指示其他蛋白具有与gp4-ha-vsv而非抗ha抗体的直接相互作用。此条带的大小与gp2-myc-vsv(泳道6)或gp3-flag-vsv(泳道7)相似,指示与gp4相互作用的此蛋白可为gp2、gp3或二者。co-ip中使用抗flag或抗myc抗体的其他条带(泳道4)的后续探针结果为对二者均为阳性(未图标),指示此条带含有gp2和gp3蛋白二者。因此,来自此实验及其他实验的结论为针对gp表面表达引入的修饰不改变其四级结构。
在修饰之后重新靶向的蛋白维持与cd163受体的相互作用。确保重新靶向蛋白的恰当折叠的下一步骤展示出其仍然维持其与受体(猪cd163)相互作用的能力。表达重新靶向的蛋白的质粒中的每一个与表达cd163(结构域4-9)的质粒一起共转染,先前展示为足以介导病毒进入靶标细胞。细胞裂解物的一个部分与抗vsv抗体(对包膜蛋白具有特异性)一起免疫沉淀,并且其他部分与抗cd163抗体一起免疫沉淀。与抗cd163抗体一起沉淀的裂解物用与生物素缀合的抗cd163抗体探测以控制cd163输入至每一co-ip反应中(图8c)。与抗vsv一起免疫沉淀的裂解物一式两份地运行,并且一个膜用抗vsv-hrp探测(图8a)以测量经修饰的gp的量,并且另一膜用抗cd163探测(图8b)以测量与经修饰的包膜糖蛋白免疫共沉淀的cd163的量。
所有经修饰的次要包膜糖蛋白均与cd163相互作用,而经修饰的gp5(用作阴性对照的主要糖蛋白)与cd163的相互作用弱得多或不可检测。
实施例2-用汇集的表达prrsv包膜基因的质粒接种动物
将三十二只3周龄的猪分成4组,每组8只动物(表2)。
表2:研究细节
野生型组接受表达非靶向gp的3种质粒的汇集,重组组接受表达重新靶向的gp的三种质粒的汇集(即图5b至5d),模拟组接受编码狂犬病糖蛋白的质粒,而未经接种的组仅接受tris-edta缓冲液。每一质粒的浓度为约1μg/μl,并且约400μg每一质粒以每耳垂200μl施用。在4次免疫接种之后,将每一组进一步划分并且加强含经杀死的疫苗的ts6佐剂(us7,371,395b2,授予merial,并且以全文引用的方式并入本文中),或接受第5轮dna免疫接种。
虽然当与狂犬病-g或未经接种的组比较时,在经汇集的质粒中的任一个接种的动物中呈现出针对肺损伤的保护提高的趋势,但所有组之间的平均值无统计学上显著差异。接受靶向与重新靶向的质粒的组之间也无显著差异。
因此,申请人接着进行将所有基因放在单一载体内以实现在单一细胞内的同时表达,以促进prrsv包膜蛋白的相互作用/寡聚化。
实施例3-表达prrsv基因的病毒载体的构建和测试
细胞和培养基。将hek293细胞(atcc)在37℃下在5%co2中维持在具有10%胎牛血清(moregate批号81827101)的mem(gibco编号11095)中。这些细胞用于复苏重组腺病毒(vad3041、vad3042、vad3038、vad3033和vad3067)和制备病毒储备液。
病毒载体和免疫原的构建。prrsv的次要包膜蛋白包括gp2(orf2)、gp3(orf3)、gp4(orf4)和e(orf2b)。这些蛋白中的每一个的dna序列获自genbank登录号u87392(vr2332、prrsvii型)。vr2332(北美病毒株)表示prrsv的两种已知主要血清型中的一个(done等人,1996)。另一个原型lelystad代表已在西欧分离的至少大部分病毒株。每一蛋白的经密码子优化的序列当与适当启动子一起构建时以自单一病毒载体表达所有蛋白(图1)。在各种情况下,sv40(猴病毒40)和cmv(巨细胞病毒)启动子分别驱动gp2和gp4的表达,在对置方向上,如由箭头所指示。设想这些启动子可交换,使得sv40可驱动gp4的表达,并且cmv可驱动gp2的表达。这样的变化形式对本领域技术人员将为明显的。重要的是,由于所公开的prrsv次要蛋白在引发安全并且保护性的免疫反应中起到的至关重要的作用,申请人充分期望以下方法同样很好地适用于所有prrsv病毒株。因此lelystad次要蛋白的经密码子优化的形式可利用常规方法制备,并且所得序列克隆至本发明的重组载体中。
在所有ad5prrsv构建体中,次要包膜糖蛋白gp3的表达利用内部核糖体入口位点(ires)促进。次要包膜糖蛋白e在vad3041和vad3067中的表达(图1c和1d)通过位于ad5构建体中紧随gp2编码区的自切割肽(p2a)的存在来实现。
另外,来自sv40和cmv启动子的转录物的半衰期通过添加来自sv40或胸苷激酶(tk)的聚a尾(pa)来增强。attl1和attl2位点(图1中所展示的每一插入序列的最左边和右边)用于利用lr重组gatewaytechnology(invitrogen)将整个合成片段插入至腺病毒基因组中(由此形成vad3042、vad3038、vad3041和vad3067)。图1的插入序列以化学方式合成(genscript)以含有用于克隆至表达克隆中以产生重组ad5的适当限制位点(gatewaytechnology,invitrogen)。再一次,设想到关于哪些组件促进哪些具体prrsv基因表达的变化形式,并且完全在阅读本发明的本领域技术人员的技能范围内。
因此,组装次要蛋白的多种组合以便重组至ad5载体中:一个仅含有三种次要蛋白而不含e(vad3042)(图1a;seqidno:2);一个含有rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4蛋白而不含e(vad3038)(图1b;seqidno:3);一个含有所有四种经密码子优化的次要蛋白gp2、gp3、gp4和e(vad3041)(图1c;seqidno:3);并且一个含有所有四种经密码子优化的次要蛋白rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4和e(vad3067)(图1d;seqidno:4)。
表3:构建体内的特征的位置
产生病毒。表达克隆通过使用gatewaytechnology(invitrogen)用目的载体对进入载体进行lr重组产生。重组腺病毒vad3041、vad3042和vad3038通过用转染试剂转染hek293细胞中的线性化表达克隆产生。在复苏之后,各病毒通过冻融循环和通过离心澄清细胞残渣进行收集。对于传代,各病毒接种至hek293细胞的单层中并且在感染后大致3-4天,病毒通过冻融循环和通过离心澄清进行收集。进行三个传代以制备病毒储备液,其储存于-80℃。作为阴性对照,猪流感病毒(siv)的经密码子优化的血球凝集素(ha)基因在ad5病毒载体(vad3033)中类似地组装。
病毒效价。hek293细胞以每板7×105个细胞的密度接种在具有含2%fbs(moregate批号81827101)、非必需氨基酸(gibco编号11140)、抗生素-抗霉剂(gibco编号15240)的mem(gibco编号11095)培养基的三个96孔板中。在感染当天,各板用100μl/孔10-3至10-10稀释的病毒感染。感染后第10天读取病毒效价,并且三个板的平均值用于计算效价。vad3041p.3的第3次传代储备液效价为109.03tcid50/ml,并且vad3042p.3为108.90tcid50/ml。vad3038p.3的第3次传代储备液效价为109.93tcid50/ml,并且vad3042p.3的另一批次为109.97tcid50/ml。
从每一病毒储备液提取病毒dna,并且如指导使用铂pcrsupermixhighfidelity(invitrogen编号12532)用引物pad正向(5’-gactttgaccgtttacgtggagac-3’)(seqidno:26)和pad反向(5’-ccttaagccacgcccacacatttc-3’)(seqidno:27)扩增。pcr扩增子为预期的相同的尺寸:例如对于vad3041,4709bp;对于vad3042,4408bp(图4)。来自每一重组腺病毒的pcr扩增子的核苷酸序列与进入载体中所构建的一致(描述在图1中),并且转基因盒的核苷酸序列中无变化(prrsv基因和启动子和多聚a尾)。
来自重组腺病毒的重新靶向的次要包膜蛋白的表达。来自重组腺病毒的经修饰的包膜蛋白中的每一个在单一细胞内的同时表达通过使用双重免疫荧光分析证实。重组vad3038用于以高moi感染汇合hek293单层,并且在48小时之后固定细胞并利用ifa观测重组抗原的表达。所有蛋白均展示出很好地表达,包括在细胞表面上(图9a和9b)。
重要的是,先前展示为强烈局部胞内表达并且无可检测的表面表达的gp2(其当单独表达时有缺陷)的表达已改进,具有弥散的胞内表达和明晰的细胞表面表达(图9c)。这指示经修饰的gp2的恰当折叠和转运可能依赖于gp3和/或gp4的共表达。此结果提示中和表位的形成需要利用次要蛋白之间的相互作用形成高阶结构。
实施例4-测试ad5prrsv疫苗的安全性和功效的临床试验
六十(60)只猪随机分成4组,每组含有15只动物(表3)。第1组接受仅表达gp2、gp3和gp3的vad3038,而第2组接受进一步表达e的vad3041。第3组接受表达重新靶向的gp2、gp3和gp4的vad3042,并且第4组接受表达sivha的vad3033(阴性对照)。接受腺病毒疫苗的组通过在每一鼻孔中施用浓度约108-9tcid50/ml的1ml制剂(总共2ml)来进行初免。这些组在21天之后利用肌肉内施用的相同制剂加强。在实验启动42天之后,所有动物均用prrsvnadc20病毒株经鼻内攻击。所有动物在攻击2周之后处死,并且检查肺损伤,并且收集样品用于分析组织和血清中的病毒效价,如图9中所指示。
表3:接种试验方案
一般而言,数据展现出,虽然使用编码次要包膜蛋白gp2、gp3和gp4的单一载体(vad3042)的接种与阴性对照相比不赋予任何显著优点,但添加e次要蛋白(vad3041)在针对来自prrsv攻击的肺损伤的保护方面产生显著差异。此外,次要蛋白(vad3038)的重新靶向也产生显著差异(图11)。
因此,本文公开的数据和结果支持通常可适用的模型,其中针对prrsv攻击的保护由针对表面蛋白中的一个(例如gp2)或利用蛋白的三级/四级结构/布置形成和呈现的表面的寡聚结构的抗体提供。照此,这些保护抗体至少部分地通过干扰病毒蛋白与细胞受体的结合从而阻断prrsv感染来起作用。
在本发明之前,尚不知e蛋白与病毒粒子中的其余次要蛋白或其他蛋白的相互作用为诱发保护性免疫的先决条件。本发明的接种试验由此已揭露,单独或与gp2、gp3和gp4中的一个或多个组合的次要蛋白e在自猪科动物引发针对有毒性的prrsv攻击的显著较高保护方面的惊人并且出人意料的作用。
申请人设想,例如,中和表位可例如直接位于e蛋白上,或其可在e蛋白存在下利用次要蛋白中的任一个或组合来诱导。考虑到现有技术参考文献,此发现为完全出人意料的并且惊人的。因此,此偶然发现不仅鉴别出prrsv保护性抗原组合物,其充当开发不含活prrsv的疫苗的基础,而且打开用以阐明蛋白-蛋白/病毒-细胞受体相互作用的prrsv研究的新领域。
考虑到数据和结果,申请人设想e+次要蛋白的其他组合(例如e+gp2;e+gp2+gp3;e+gp2+gp4;及其类似组合)将类似地克服将“中和表位”(本文定义为能够在动物中引发保护性免疫反应,包括产生病毒中和抗体的表位)呈现至动物免疫系统的问题。此外,结果指示prrsv次要蛋白的重新靶向引发类似惊人的安全并且保护性的免疫。
申请人由此已揭露用于克服单独表达的gp2、gp3和gp4不能将病毒中和表位呈现至宿主动物免疫系统并且引发针对有毒性的prrsv攻击的保护性免疫反应的两种主要但相关的方法。
此外,本申请首次公开prrsv包膜次要蛋白的免疫原性可充分增强以引发保护性免疫反应。设想这些本发明方法可广泛应用于其他病毒,尤其细胞定位在妨碍病毒中和表位呈现至宿主免疫系统方面起作用的情况。
实施例4-测试ad5prrsv疫苗的安全性和功效的临床试验
另一研究使用实施例3中所公开的方法进行,并且表4提供概览。腺病毒载体具有根据以下的插入序列:vad3038(gp234-rtrg);vad3067(gp234-rtrg+e-opt);vad3064(m-gp5-gp5a-rtrg);vad3041(gp234e);vad3069(np-m-gp5-gp5a);vad3046(siv-ha)。
表4:接种试验方案(im=肌内;in=鼻内)
总结。数据显示用经杀死的疫苗加强的载体表达的重新靶向的prrsv次要包膜蛋白降低猪中血清病毒负载并且引起免遭肺损伤的显著保护(图18和19)。即使考虑到实施例3中呈现的数据,在此研究之前也尚未有预测到这些数据。现已进行此项研究,申请人设想免遭肺损伤的惊人的保护以及血清病毒负荷的减少可归因于重新靶向的次要包膜蛋白的强预致敏作用(图20)。也不可预知的为以下发现:与实施例3中所公开的相反结果(即,施用含有e+wt次要包膜蛋白的腺构建体显著减少肺损伤)对比,将e添加至重新靶向的次要包膜蛋白未展示出免遭肺损伤的显著保护(图21和22)。考虑到图23和24中所描绘的相互作用数据,申请人设想此免遭肺损伤的保护的缺失可能由野生型e与重新靶向的次要包膜蛋白的不利相互作用(即由于重新靶向的蛋白中存在的改变的tm和ct结构域)引起。
如上详细描述本发明的优选实施方案,应理解,由以上段落定义的本发明不限于以上说明中所述的特定细节,因为许多明显变化可在不偏离本发明的精神或范畴的情况下进行。
申请引用的文件中所引用或参考的所有文件、和本文中所引用或参考的所有文件(“本文中所引用的文件”)和本文中所引用的文件中所引用或参考的所有文件以及本文中或以引用的方式并入本文中的任何文件中所提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品薄页皆以引用的方式并入本文中,并且可用于本发明的实践。
序列表
<110>merial,inc.
mebatsion,teshome
kassa,aemro
kim,taejoong
<120>含prrsv次要蛋白的重组病毒载体及其制造方法与用途
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serglyglysergluleuvalgluglytrpphesersertrplysser
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serilealaserphephepheileileglyleuileileglyleuphe
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leuvalleuargvalglyilehisleucysilelysleulyshisthr
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lyslysargglniletyrthraspileglumetasnargleuglylys
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<223>vr2332prrsvrtg-gp3dna(经密码子优化的,重新靶向)
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gaaatcttcggaattgggaacgtgtctcgggtgtacgtcgacatcaagcaccagctcatt420
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gluleuvalgluglytrpphesersertrplysserserilealaser
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phephepheileileglyleuileileglyleupheleuvalleuarg
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valglyilehisleucysilelysleulyshisthrlyslysarggln
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iletyrthraspileglumetasnargleuglylys
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metaspalametlysargglyleucyscysvalleuleuleucysgly
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alavalphevalserprosercyslysprocyspheserserserleu
202530
alaaspilelysthrasnthrthralaalaalaserphealavalleu
354045
glnaspilesercysleuarghisargaspseralaserglualaile
505560
arglysileproglncysargthralaileglythrprovaltyrval
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thrilethralaasnvalthraspgluasntyrleuhisserserasp
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leuleumetleusersercysleuphetyralaserglumetserglu
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lysglyphelysvalvalpheglyasnvalserglyilevalalaval
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cysvalasnphethrsertyrvalglnhisvallysgluphethrgln
130135140
argserleuvalvalasphisvalargleuleuhisglyglysertyr
145150155160
protyraspvalproasptyralaglyglyserglyglyserglygly
165170175
sergluleuvalgluglytrpphesersertrplysserserileala
180185190
serphephepheileileglyleuileileglyleupheleuvalleu
195200205
argvalglyilehisleucysilelysleulyshisthrlyslysarg
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glniletyrthraspileglumetasnargleuglylys
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>以下的替代符号:vr2332prrsvrtg-e(经密码子优化的,重新靶向)
<220>
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<222>(1)..(10)
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<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>以下的替代符号:vr2332prrsvrtg-e多肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
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xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa
1510
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<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
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1510
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<213>人工序列
<220>
<223>以下的替代符号:vad3033重组前插入序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
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<211>24
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