本发明属于药物化学领域，涉及新的式i结构苯并噻嗪酮类化合物及其制备方法和药物用途。本发明所述的式i结构苯并噻嗪酮化合物是糖原合成激酶-3β(gsk-3β)的变构调节抑制剂，能在微摩尔浓度抑制gsk-3β活性，且对测试的多种蛋白激酶均无明显的抑制作用。所述的化合物可用于制备治疗卵巢癌肿瘤的药物或制备预防或治疗与gsk-3β相关疾病的药物。
背景技术：
现有技术公开了糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，gsk-3β)是一种高度保守的多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因其能够磷酸化糖原合成酶并使其失活而得名。研究显示，gsk-3β广泛参与体内多种重要的生理过程，在调控细胞的分化、代谢、凋亡以及基因表达等方面都起着重要作用，与ⅱ型糖尿病、阿尔茨海默病、肿瘤、中风、双向情感障碍和炎症等疾病的发生发展密切相关。
有研究报道，gsk-3β在结肠癌、白血病、胰腺癌及卵巢癌中异常表达并促使肿瘤的发展(sharkooria,etal.,biochembiophysrescommun.334(2005)1365-1373,wangz,etal.,nature455(2008)1205-1210,ougolkovav,etal.,cancerres.65(2005)2076-2081,caoq,etal.,cellres.16(2006)671-677)。
资料公开了卵巢癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，因其在早期无明显的临床症状及在治疗过程中的耐药性问题，卵巢癌的5年生存率低于43％(http://www.ons.gov.uk/ons/dcp171778_240942.pdf.)。目前，临床上治疗卵巢癌的方法为手术切除并结合紫杉醇和铂类为主的药物治疗。尽管铂类结合的药物治疗可以缓解并提高患者的生存率，然而高复发率和复发后的耐药性问题仍是导致其高死亡率的主要原因之一。
有研究表明，gsk-3β能够促进卵巢癌细胞的增殖，因此可能会成为治疗卵巢癌的一个潜在靶点。2006年licl被报道显示出较好的体内抗卵巢癌细胞增殖作用，但生理水平的licl对卵巢癌的作用很小(caoq,etal.,cellres.16(2006)671-677,novetskyap,etal.,intjgynecolcancer23(2013)361-366)。近期研究表明，atp竞争性抑制剂bio和azd1080在体外均表现出抗卵巢癌增殖作用(yuas,etal.,tumorbiol.37(2016)4857-4864,chens,etal.,drugdes.devel.ther.10(2016)1225-1232)，为gsk-3β作为治疗卵巢癌靶点提供了依据。
目前报道的大多数gsk-3β抑制剂均为atp竞争性抑制剂，由于atp结合区域在500多种激酶中高度保守，因此作用于该活性区域所带来的选择性及特异性问题不容忽视。与atp竞争性抑制剂不同，变构抑制剂通过调节酶的构象而并非直接作用于atp结合区而发挥抑制活性(mcinnesc,etal.,curr.pharm.des.11(2005)1845-1863)。因此，变构抑制剂可作为实现选择性和特异性的一种新的策略。
基于现有技术的研究现状，本申请的发明人拟提供新的结构的苯并噻嗪酮类化合物及其制备方法和药物用途，所述的化合物可用于制备新的治疗卵巢癌肿瘤的药物或制备预防或治疗与gsk-3β相关疾病的药物。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一类对gsk-3β具有抑制活性的新的苯并噻嗪酮化合物。本发明所述的苯并噻嗪酮类化合物，其结构通式如式i所示：
其中，x选自氧、硫或氮原子，优选为硫原子；r选自
本发明的另一目的是提供如式i所示苯并噻嗪酮化合物的制备方法。
本发明所述如式i所示的苯并噻嗪酮化合物是按以下式ii所述合成方法制备，化合物a和化合物b反应生成化合物c，化合物c用于制备本发明所述的式i化合物。
其中，x选自氧、硫或氮原子；r1选自
本发明中反应所用溶剂为常用溶剂，可选自二氯甲烷，甲苯，n-甲基吗啉(nmm)，n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，二甲基亚砜(dmso)，其中优选溶剂为二氯甲烷；反应温度为5-50℃，优选反应温度为25-35℃；催化剂选自苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐/n，n-二异丙基乙胺(hbtu/dipea)，2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯/n，n-二异丙基乙胺(hatu/dipea)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑(edci/hobt)，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸酯n，n-二异丙基乙胺(tbtu/dipea)，其中优选催化剂为hatu/dipea，hbtu/dipea。
本发明的再一个目的是提供式i所示的苯并噻嗪酮化合物在制备预防或治疗与gsk-3β相关疾病的药物中的用途。
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮化合物经体外酶水平测试，显示出较好的gsk-3β抑制活性，且对多种激酶如cdk1，cdk2，egfr，c-met，c-kit等均无明显抑制，显示出较高的激酶选择性；
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮化合物经酶动力学测试表明对gsk-3β的作用模式为非atp竞争；
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮化合物在体内外均表现出较好的抗卵巢癌细胞增殖活性，可用于制备预防或治疗卵巢癌疾病的药物，但不受限与此。
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮类化合物可用于制备预防或治疗与gsk-3β相关疾病的药物。
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮类化合物可用于制备预防或治疗糖尿病、阿耳茨海默氏病、肿瘤的药物，但不受限于此。
附图说明
图1是所述的式i结构苯并噻嗪酮化合物中的一个实施例18g对gsk-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见，gs-2浓度不变时，20μm和50μm浓度的18g的直线与对照组直线相交于x轴，表明18g为非atp竞争型抑制剂(a)，atp浓度不变时，20μm和50μm浓度的18g的直线与对照组直线相交于x和y轴以外，表明18g为非底物竞争型抑制剂(b)。
图2是所述的式i结构苯并噻嗪酮类化合物中的一个实施例19g对gsk-3β活性测试的动力学数据双倒数图，由图中可见，gs-2浓度不变时，6.25μm和12.5μm浓度的19g的直线与对照组直线相交于x轴，表明19g为非atp竞争型抑制剂(a)，atp浓度不变时，6.25μm和12.5μm浓度的19g的直线与对照组直线相交于x和y轴以外，表明19g为非底物竞争型抑制剂(b)。
图3是所述的式i结构苯并噻嗪酮类化合物中的一个实施例18f对卵巢癌细胞系a2780的细胞周期影响图。(a)化合物18f对细胞g1期有阻滞作用并呈现剂量依赖性，(b)a2780各个周期的比例。
图4是所述的式i结构苯并噻嗪酮类化合物中的一个实施例18f对卵巢癌细胞系ovca433的细胞凋亡影响图。(a)随着化合物浓度的增加(10,15,20μm)，早期凋亡和晚期凋亡细胞比例也随之增加，(b)ovca433细胞凋亡比例。结果表明化合物18f可引起ovca433的细胞凋亡。
图5是所述的式i结构苯并噻嗪酮类化合物中的一个实施例18f对卵巢癌小鼠荷瘤模型的药效作用图。(a)平均瘤块体积和(b)平均小鼠体重每两天分别用游标卡尺和电子天平量取一次并计算，给药14天后，断颈法处死小鼠取出瘤块称重(c)和拍照(d)。
具体实施方式：
下面给出实施例进一步说明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常说明常规条件或按照制造厂商所建议的条件。所采用的原料为商业上可购得的或者可以很容易地由本领域技术人员根据已知文献方法制备的。
本发明所述的式i结构的苯并噻嗪酮类化合物的制备如以下实施例所描述。
实施例1
制备4-乙基-n-(1-壬酰哌啶-4-基)-3-氧-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17a)
制备4-乙基-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(3)
向100ml圆底烧瓶中加入(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(2.5g,0.015mol)、氢氧化钠粉末(0.7g,0.016mol)、n,n-二甲基甲酰胺(50ml)、溴乙烷(1.5ml,0.019mol)，室温反应，tlc检测原料点消失停止反应。二氯甲烷萃取，合并有机层，依次用1n的盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂，得淡黄色油状物3.3g，直接用于下步反应。制备2-甲氧甲酰基-4-乙基-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(5)
向100ml三口瓶中加入重蒸后的dmf(40ml)、60％nah(1.2g,0.083mol)，冰盐浴搅拌下加入dmf稀释的3(2.9g,0.015mol)，冰盐浴下搅拌0.5h，加入碳酸二甲酯(2.5ml,0.025mol)，撤去冰盐浴室温反应5h。饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取，合并有机层并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得淡黄色油状物3.76g；
制备2-羧基-4-乙基-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(6)
将5(1.0g,4mmol)加入到圆底烧瓶中，加入1mkoh甲醇/水溶液(1:1)40ml，室温搅拌4h。减压除去甲醇，加入20ml水，乙酸乙酯除去脂溶性杂质，冰浴下浓盐酸调水层ph至4，乙酸乙酯萃取三次，合并有机层并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得淡黄色油状固体1.0g；
制备叔丁基-4-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)1,4-苯并噻嗪-2-甲酰胺)哌啶-1-羧酸酯(8)
向50ml圆底烧瓶中加入6(0.5g,0.002mol)、1-boc-4-氨基哌啶(0.5g,0.002mol)、hbtu(1.6g,0.004mol)、dipea(1.1ml,0.006mol)、二氯甲烷(30ml)，室温搅拌3h。二氯甲烷萃取三次，合并有机层，依次用1n的盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得粗品。粗品经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得淡黄色油状物0.65g，收率73％；
制备4-乙基-3-oxo-n-(哌啶-4-基)-3,4-二氢-(2h)1,4-苯并噻嗪-2-甲酰胺(9)
向反应瓶中加入8(0.6g,0.002)、tfa(3ml)、二氯甲烷(20ml)，室温反应2h。减压蒸去溶剂，饱和碳酸钠水溶液调ph值至8，二氯甲烷萃取三次，合并有机层并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得淡黄色油状物0.43g，收率87％；
制备4-乙基-n-(1-壬酰哌啶-4-基)-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17a)
向反应瓶中加入9(0.3g,0.9mmol)、壬酸(163μl,1mmol)、hbtu(0.534g,1mmol)、dipea(489μl,2.7mmol)、二氯甲烷(10ml)，室温搅拌4h。二氯甲烷萃取三次，合并有机层，依次用1n的盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂得粗品。粗品经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:2)得类白色固体98mg，收率22％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.12(d,j＝7.6hz,1h),7.40-7.38(d,j＝7.6hz,1h),7.31-7.29(m,2h),7.10-7.03(m,1h),4.25(s,1h),4.15-3.92(m,3h),3.76-3.62(m,2h),3.10-3.00(m,1h),2.75-2.67(m,1h),2.28-2.24(m,2h),1.79-1.24(m,16h),1.14(t,j＝7.2hz,3h),0.85(t,j＝6.98hz,3h)。
实施例2
制备n-(1-癸酰哌啶-4-基)-4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17b)
制备方法同17a，用癸酸代替壬酸，反应溶剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，反应温度25℃，催化剂为tbtu/dipea，得白色片状固体，收率46％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.12(d,j＝7.6hz,1h),7.39(d,j＝7.6hz,1h),7.30-7.29(m,2h),7.05-7.04(m,1h),4.25(s,1h),4.16-3.90(m,3h),3.76-3.65(m,2h),3.10-3.00(m,1h),2.75-2.67(m,1h),2.26-2.25(m,2h),1.76-1.24(m,18h),1.14(t,j＝6.8hz,3h),0.85(t,j＝6.6hz,3h)。
实施例3
制备4-乙基-3-oxo-n-(1-十一酰哌啶-4-基)-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17c)
制备方法同17a，用十一烷酸代替壬酸，白色片状固体，收率63％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.12(d,j＝7.2hz,1h),7.39(d,j＝7.2hz,1h),7.30-7.29(m,2h),7.06-7.04(m,1h),4.25(s,1h),4.16-3.90(m,3h),3.76-3.65(m,2h),3.09-3.00(m,1h),2.75-2.67(m,1h),2.26-2.25(m,2h),1.76-1.24(m,20h),1.14(t,j＝7.0hz,3h),0.85(t,j＝6.4hz,3h)。
实施例4
制备n-(1-月桂酰哌啶-4-基)-4-乙基-3-oxo--3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17d)
制备方法同17a，用月桂酸代替壬酸，白色片状固体，收率63％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.12(d,j＝7.6hz,1h),7.40-7.38(d,j＝8.0hz,1h),7.30-7.29(m,2h),7.06-7.02(m,1h),4.25(s,1h),4.16-3.90(m,3h),3.76-3.62(m,2h),3.09-3.00(m,1h),2.75-2.67(m,1h),2.28-2.24(m,2h),1.76-1.24(m,22h),1.14(t,j＝7.0hz,3h),0.85(t,j＝6.6hz,3h)。
实施例5
制备4-乙基-3-oxo-n-(1-十四酰哌啶-4-基)-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17e)
制备方法同17a，用肉豆蔻酸代替壬酸，白色片状固体，收率45％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.12(d,j＝7.2hz,1h),7.38(d,j＝6.8hz,1h),7.30-7.29(m,2h),7.05-7.04(m,1h),4.25(s,1h),4.16-3.92(m,3h),3.76-3.67(m,2h),3.09-3.00(m,1h),2.75-2.67(m,1h),2.26-2.25(m,2h),1.76-1.23(m,26h),1.14(t,j＝7.0hz,3h),0.85(t,j＝6.0hz,3h)。
实施例6
制备4-乙基-3-oxo-n-(1-十五酰哌啶-4-基)-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17f)
制备方法同17a，用十五烷酸代替壬酸，白色片状固体，收率82％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.08(d,j＝7.6hz,1h),7.35(d,j＝7.7hz,1h),7.26(d,j＝4.1hz,2h),7.01(dt,j＝8.8,4.4hz,1h),4.21(s,1h),4.15–3.97(m,2h),3.96-3.84(m,1h),3.66(d,j＝18.7hz,2h),3.01(q,j＝12.7hz,1h),2.67(q,j＝11.3hz,1h),2.21(t,j＝8.3hz,2h),1.74-1.60(m,1h),1.45-1.35(m,3h),1.22-1.16(m,24h),1.11(t,j＝7.1hz,3h),0.81(t,j＝6.6hz,3h)。
实施例7
制备4-乙基-3-oxo-n-(1-棕榈酰哌啶-4-基)-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰胺(17g)
制备方法同17a，用棕榈酸代替壬酸，白色固体，收率83％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.07(d,j＝7.6hz,1h),7.34(d,j＝7.7hz,1h),7.26(d,j＝4.1hz,2h),7.00(dt,j＝8.3,4.4hz,1h),4.21(s,1h),4.14–3.96(m,2h),3.96-3.85(m,1h),3.65(d,j＝17.0hz,2h),3.01(q,j＝12.7hz,1h),2.67(q,j＝11.4hz,1h),2.28-2.26(m,2h),1.75-1.60(m,1h),1.45-1.35(m,3h),1.20-1.16(m,26h),1.10(t,j＝7.0hz,3h),0.81(t,j＝6.5hz,3h)。
实施例8
制备叔丁基-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)1,4-苯并噻嗪-2-甲酰胺)哌啶-4-基)-氨基甲酸酯(11)
制备方法同8，用4-boc-氨基哌啶代替1-boc-4-氨基哌啶，得淡黄色油状物，收率95％。esi-msm/z418.0[m-h]-。
制备2-(4-氨基哌啶-1-碳酰基)4-乙基-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(12)
制备方法同9，得淡黄色油状物，收率92％。esi-msm/z320.0[m+h]+。
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-壬酰胺(18a)
制备方法同17a，用12代替9，反应溶剂为甲苯，催化剂为edci/hobt，反应温度50℃，得白色固体，收率52％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.83-7.76(m,1h),7.40(dd,j＝7.6,2.4hz,1h),7.31-7.29(m,2h),7.07-7.02(m,1h),5.06-5.04(m,1h),4.08-3.92(m,3h),3.80-3.72(m,2h),3.15-3.04(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.05-2.01(m,2h),1.72-1.23(m,16h),1.16-1.12(m,3h),0.87-0.84(m,3h)。
实施例9
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-癸酰胺(18b)
制备方法同17a，用12代替9，用癸酸代替壬酸，得白色片状固体，收率71％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.82-7.76(m,1h),7.40(d,j＝7.2hz,1h),7.31-7.29(m,2h),7.07-7.02(m,1h),5.06-5.04(m,1h),4.08-3.92(m,3h),3.80-3.72(m,2h),3.14-3.04(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.04-2.01(m,2h),1.72-1.23(m,18h),1.16-1.12(m,3h),0.86-0.83(m,3h)。
实施例10
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-十一酰胺(18c)
制备方法同17a，用12代替9，用十一烷酸代替壬酸，得白色片状固体，收率68％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.83-7.76(m,1h),7.40(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),7.32-7.31(m,2h),7.07-7.02(m,1h),5.07-5.04(m,1h),4.09-3.92(m,3h),3.80-3.72(m,2h),3.14-3.03(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.05-2.01(m,2h),1.72-1.69(m,2h),1.48-1.23(m,18h),1.16-1.12(m,3h),0.86-0.83(m,3h)。
实施例11
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-月桂酰胺(18d)
制备方法同17a，用12代替9，用月桂酸代替壬酸，得白色片状固体，收率57％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)7.83-7.76(m,1h),7.40(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),7.32-7.31(m,2h),7.07-7.02(m,1h),5.07-5.04(m,1h),4.09-3.92(m,3h),3.80-3.72(m,2h),3.15-3.04(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.05-2.01(m,2h),1.72-1.69(m,2h),1.48-1.23(m,20h),1.17-1.12(m,3h),0.86-0.83(m,3h)。
实施例12
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-十四酰胺(18e)
制备方法同17a，用12代替9，用肉豆蔻酸代替壬酸，得白色片状固体，收率28％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.82-7.76(m,1h),7.40(d,j＝6.4hz,1h),7.31-7.29(m,2h),7.05-7.04(m,1h),5.06-5.04(m,1h),4.09-4.00(m,3h),3.77-3.73(m,2h),3.15-3.04(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.03-2.02(m,2h),1.69-1.68(m,2h),1.46-1.14(m,27h),0.85-0.84(m,3h)。
实施例13
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-十五酰胺(18f)
制备方法同17a，用12代替9，用十五烷酸代替壬酸，得白色片状固体，收率58％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.82-7.76(m,1h),7.40-7.31(m,3h),7.05-7.04(m,1h),5.06-5.04(m,1h),4.05-3.96(m,3h),3.77-3.75(m,2h),3.14-3.04(m,1h),2.81-2.76(m,1h),2.03-2.02(m,2h),1.69-1.68(m,2h),1.46-1.15(m,29h),0.83(t,j＝6.1hz,3h)。
实施例14
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-棕榈酰胺(18g)
制备方法同17a，用12代替9，用棕榈酸代替壬酸，得白色片状固体，收率38％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.82-7.76(m,1h),7.40(d,j＝6.4hz,1h),7.31-7.29(m,2h),7.05-7.04(m,1h),5.06-5.03(m,1h),4.08-3.96(m,3h),3.77-3.75(m,2h),3.14-3.04(m,1h),2.81-2.75(m,1h),2.03-2.02(m,2h),1.69-1.68(m,2h),1.46-1.15(m,31h),0.85-0.84(m,3h)。
实施例15
制备n-(1-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)苯并[1,4]噻嗪-2-甲酰)哌啶-4-基)-十七酰胺(18h)
制备方法同17a，用12代替9，用十七烷酸代替壬酸，得白色片状固体，收率70％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.74(dd,j＝18.1,7.6hz,1h),7.36(d,j＝7.8hz,1h),7.27(s,2h),7.01(dt,j＝8.0,4.3hz,1h),5.03-4.97(m,1h),4.10–3.86(m,3h),3.70(d,j＝18.7hz,2h),3.16–3.16(m,1h),2.74(t,j＝12.8hz,1h),2.03–1.93(m,2h),1.65(s,2h),1.42(t,j＝7.6hz,2h),1.20-1.13(m,28h),1.20–1.08(m,3h),0.81(t,j＝6.6hz,3h)。
实施例16
制备叔丁基-4-(4-乙基-3-oxo-3,4-二氢-(2h)1,4-苯并噻嗪-2-甲酰基)哌嗪-1-羧酸酯(14)
制备方法同8，用n-boc-哌嗪代替1-boc-4-氨基哌啶得白色固体，收率92％。esi-msm/z404.0[m-h]-。
制备4-乙基-2-(哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(15)4-ethyl-2-(piperazine-1-carbonyl)-2h-benzo[b][1,4]thiazin-3(4h)-one
制备方法同9，得淡黄色油状物，收率97％。esi-msm/z306.0[m+h]+。
制备4-乙基-2-(4-壬酰哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19a)
制备方法同17a，用15代替9，溶剂为n-甲基吗啉(nmm)，反应温度5℃，催化剂为hatu/dipea，得白色固体，收率83％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),6.99-7.07(m,1h),5.13-5.01(m,1h),4.06-3.94(m,2h),3.59-3.34(m,8h),2.31-2.30(m,2h),1.47-1.25(m,12h),1.15(t,j＝6.8hz,3h),0.86(t,j＝6.8hz,3h)。
实施例17
制备4-乙基-2-(4-癸酰哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19b)
制备方法同17a，用15代替9，用癸酸代替壬酸，得白色片状固体，收率73％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),7.06-7.05(m,1h),5.13-5.02(m,1h),4.06-3.86(m,2h),3.52-3.34(m,8h),2.28(q,j＝6.6hz,2h),1.45(t,j＝7.3hz,2h),1.27–1.17(m,12h),1.15(t,j＝6.8hz,3h),0.86(t,j＝6.8hz,3h)。
实施例18
制备4-乙基-2-(4-十一酰哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19c)
制备方法同17a，用15代替9，用十一烷酸代替壬酸，得白色片状固体，收率71％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),7.06-7.05(m,1h),5.13-5.07(m,1h),4.06-3.95(m,2h),3.52-3.34(m,8h),2.31-2.29(m,2h),1.47-1.13(m,19h),0.85(t,j＝6.4hz,3h)。
实施例19
制备2-(4-月桂酰哌嗪-1-甲酰基)-4-乙基--(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19d)
制备方法同17a，用15代替9，用月桂酸代替壬酸，得白色片状固体，收率75％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),7.06-7.05(m,1h),5.12-5.07(m,1h),4.06-3.94(m,2h),3.52-3.34(m,8h),2.31-2.29(m,2h),1.47-1.24(m,19h),1.15(t,j＝6.8hz,3h),0.85(t,j＝6.8hz,3h)。
实施例20
制备4-乙基-2-(4-十四酰哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19e)
制备方法同17a，用15代替9，用肉豆蔻酸代替壬酸，得白色片状固体，收率64％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),7.06-7.05(m,1h),5.12-5.07(m,1h),4.08-3.93(m,2h),3.52-3.39(m,8h),2.31-2.29(m,2h),1.47-1.45(m,2h),1.24-1.22(m,20h),1.14(t,j＝6.6hz,3h),0.85(t,j＝6.8hz,3h)。
实施例21
制备4-乙基-2-(4-棕榈酰哌嗪-1-甲酰基)-(2h)1,4-苯并噻嗪-3(4h)-酮(19g)
制备方法同17a，用15代替9，用棕榈酸代替壬酸，得白色片状固体，收率73％。1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.43-7.41(m,1h),7.33-7.31(m,2h),7.06-7.05(m,1h),5.12-5.07(m,1h),4.03-3.97(m,2h),3.49-3.41(m,8h),2.31-2.29(m,2h),1.47-1.15(m,29h),0.86-0.84(m,3h)。
实施例22式i结构苯并噻嗪酮类化合物对gsk-3β的体外酶抑制活性测试
采用化学发光法进行测试，荧光信号强度与剩余atp的量成正比，通过检测体系内剩余atp的量进而推算出gsk-3β磷酸化底物gs-2时消耗的atp量，从而反映酶的活性水平。计算不同浓度下化合物的抑制率，通过graphpad软件拟合出半数抑制浓度(ic50值)；
所用的主要试剂：
gsk-3β(millipore,lot#:14-306)；gs-2(吉尔生化上海有限公司)；atp·2na(sigma-aldrich)；kinase-gloluminescentkinaseassay(promegacorporation)；tdzd-8(medchemexpresstechnologies,lot#:hy-11012)；
实验方法：
在96孔板上，将4μl含不同浓度化合物的dmso溶液用14μl缓冲液稀释，依次加入2μl(20ng)的gsk-3β，20μl的gs-2(12.5μm)和atp(4μm)的缓冲液，于30℃下孵育30分钟，孵育完毕后加入40μlkinase-glo试剂，于30℃下孵育10分钟，化学发光仪计数，graphpad软件计算半数抑制浓度(ic50值)。
实施例23式i结构苯并噻嗪酮类化合物体外抑制细胞增殖活性测试
细胞培养
卵巢癌细胞系a2780和ovca433在(rpmi)-1640(hyclone,usa)培养基(加入10％胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素)中培养。细胞在co2细胞培养箱中37℃培养。当细胞复苏后传代三次以上，长至80％满时且状态良好时可用于活性测试；
mtt法
采用四氮唑mtt法测试化合物对细胞的增殖抑制活性。简言之，细胞种植于96孔板中，加入不同浓度的化合物孵育48h。然后每孔中加入20μlmtt(5mg/ml)并孵育4h。吸去上清，每孔加入150μldmso并震摇20min。酶标仪读取570nm下各孔的光密度值(od)。每个化合物在每个浓度下设三个复孔。按下式计算药物对细胞系的增殖抑制率：
细胞增殖抑制率＝(od阴性对照试-od试验)/(od阴性对照-od空白)×100％。以同一样品的不同浓度对细胞增殖抑制率作图可得到剂量反应曲线，用软件graphpadprism5分析，从中求出样品的半数抑制浓度ic50；
实验结果表明，本发明所述的式i结构苯并噻嗪酮化合物对gsk-3β和卵巢癌细胞均具有微摩尔浓度级的抑制作用，表1为式i所示苯并噻嗪酮化合物对gsk-3β和卵巢癌细胞系a2780和ovca433的体外抑制活性数据。
表1
实施例24动力学测试确定式i结构苯并噻嗪酮化合物对gsk-3β的作用模式
测试一定浓度下化合物在一系列不同atp浓度时的gsk-3β活性，计算出反应速率；通过反应速率的倒数(1/v)对atp浓度的倒数(1/[atp])作图得到lineweaver-burk；直线的相交点反映出化合物的作用类型；若化合物的直线空白对照组的直线相交于y轴，则表明化合物与atp存在竞争关系，如果相交于x轴，则表明化合物与atp不存在竞争关系；
测试一定浓度下化合物在一系列不同gs-2浓度时的gsk-3β活性，计算出反应速率；通过反应速率的倒数(1/v)对gs-2浓度的倒数(1/[gs-2])作图得到lineweaver-burk。直线的相交点反映出化合物的作用类型；若化合物的直线空白对照组的直线相交于y轴，则表明化合物与gs-2存在竞争关系，如果相交于x轴，则表明化合物与gs-2不存在竞争关系；
测试与atp作用模式时，保持gs-2浓度为6.25μm，atp的终浓度为8.0μm，4.0μm，2.0μm，1.0μm，0.5μm；运用上述体外激酶活性测试方法测试不同atp浓度下酶的活性；计算反应速率并对atp浓度进行双倒数作图；测试与gs-2作用模式时，保持atp浓度为2μm不变，gs-2的终浓度为12.5μm，6.25μm，3.13μm，1.56μm，0.78μm；运用上述体外激酶活性测试方法测试不同gs-2浓度下酶的活性；计算反应速率并对gs-2浓度进行双倒数作图。根据双倒数图判断化合物的作用模式。
实施例25对式i结构苯并噻嗪酮化合物的体外激酶选择性评价
采用酶联吸附滴定测试法(elisa)测试所述式i所示化合物对一系列酪氨酸蛋白激酶的抑制活性，对其他丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的选择性测试由英国eurofins公司完成。
elisa实验操作：(a)酶反应底物poly(glu,tyr)4:1用无钾离子的pbs(10mm磷酸钠缓冲液，150mmnacl，ph7.2-7.4)稀释成20μg/ml，125μl/孔包被酶标板，置37℃反应12-16小时。弃去孔中液体。洗板，用1xpbst(含0.1％tween-20的无钾离子的pbs，200μl/孔)洗板三次，每次5分钟。于37℃烘箱中干燥酶标板1-2小时。(b)每孔加入以反应缓冲液(50mmhepesph7.4,50mmmgcl2,0.5mmmncl2,0.2mmna3vo4,1mmdtt)稀释的atp溶液49μl，每孔中加入1μl待测试化合物，再加入50μl以反应缓冲液稀释的fgfr1、kdr激酶域重组蛋白启动反应，每次实验需设无atp对照孔两孔，置37℃摇床(100rpm)反应1小时，弃去孔中液体，1xpbst洗板三次。(c)加入抗体py99稀释液(抗体用含bsa5mg/ml的pbst1:500稀释)，100μl/孔，37℃摇床反应0.5小时，弃去孔中液体，pbst洗板三次，(d)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗稀释液(抗体用含bsa5mg/ml的pbst1:2000稀释)，100μl/孔，37℃摇床反应0.5小时，弃去孔中液体，pbst洗板三次，(e)加入2mg/ml的opd显色液100μl/孔(用含有0.03％h2o2的0.1m柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液(ph＝5.4)稀释)，25℃避光反应1-10分钟，(f)加入2mh2so450μl/孔中止反应，用可调波长式微孔板酶标仪versamax读数，波长为490nm。
以上实验结果按下述公式计算抑制率
样品的抑制率(％)＝(1-(化合物od值-无atp对照孔od值)/(阴性对照od值-无atp对照孔od值))×100％
激酶谱测试结果表明，本发明式i结构苯并噻嗪酮化合物在100μm下对31种激酶均无明显抑制作用，表现出高的激酶选择性。
表2为化合物18f在100μm浓度下对蛋白激酶的抑制率(％)数据。
表2
实施例26式i结构苯并噻嗪酮化合物对细胞周期的影响
细胞周期采用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)进行分析，2x105/孔a2780细胞种植于6孔板中，在37℃培养箱中培养贴壁后，用含dmso或不同浓度药物的培养基处理，在37℃培养箱中培养48h后，经胰酶消化，离心收集细胞，并用1xpbs洗两次，1ml冰浴预冷的70％乙醇于-20℃固定过夜。离心沉淀细胞并用1xpbs洗两次，每管细胞中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，室温避光30分钟；流式细胞仪检测，结果表明(如图3所示)，化合物18f对细胞g1期有阻滞作用。
实施例27式i结构苯并噻嗪酮化合物对细胞凋亡的影响
细胞凋亡采用annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)进行分析，2x105/孔ovca433细胞种植于6孔板中，在37℃培养箱中培养贴壁后，用含dmso或不同药物浓度的培养基处理，在37℃培养箱中培养48h后，经胰酶消化，离心收集细胞，并用1xpbs洗两次，离心收集细胞沉淀。每管加入195μlannexinv-fitc结合液并轻轻重悬细胞，依次加入5μlannexinv-fitc和10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育15分钟，流式细胞仪进行检测，结果表明(如图4所示)，化合物18f引起肿瘤细胞凋亡并具有浓度依赖性。
实施例28式i结构苯并噻嗪酮化合物对体内肿瘤增殖抑制活性的影响
六周大雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；收集对数期生长状况良好的a2780细胞，用pbs调节浓度至1×107cells/ml。皮下种植肿瘤，每只裸鼠种植两个肿瘤，每个肿瘤2×106个细胞，待瘤块长至约100mm3，随机将裸鼠分成三组，每组六只，分别腹腔注射空白溶剂(10％乙醇，10％cremophorel和80％pbs)和化合物18f，给药剂量分别为50mg/kg和30mg/kg，两天一次，持续14天，瘤块直径和小鼠体重每两天分别用游标卡尺和电子天平测量一次，肿瘤体积用公式(a×b2)/2计算，a为瘤块最大直径，b为瘤块最小直径；实验结束后，常规处理裸鼠，取瘤块并称重(本实验得到复旦大学药学院动物伦理委员会批准)；表3显示了化合物18f显著地抑制肿瘤的增长的结果，第14天时，化合物18f给药组50mg/kg和30mg/kg的平均瘤块体积为1343和1267mm3，而空白组的瘤块体积为2161mm3。实验结束时取下的瘤块重量也表明化合物18f抑瘤效果较为明显，空白组平均瘤重为1.43g，而给药组50mg/kg和30mg/kg的平均瘤重分别为0.75g和0.83g；通过比较小鼠体重的变化看出给药组50mg/kg和30mg/kg的体重相对于空白组均没有明显的降低。
表3