本发明涉及一种具有抗血栓活性的贻贝多肽的制备方法。
背景技术：
：海洋生物资源丰富、种类繁多、生物链健全及再生能力强，海洋生物约占全球生物总量的一半。多变的生活环境、漫长的进化历程使这些生物具有与陆生生物不同的生理性状，并产生许多结构新颖、作用特殊的生物活性物质，是新型生物活性物的巨大来源，具有很大的开发潜力。生物活性肽是指具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽。一般由蛋白质酶解制得，通常含有3-20个氨基酸残基，它在原蛋白质序列上没有生物活性，但是通过酸、碱或酶水解释放后具有生物活性，其活性取决于它们的氨基酸组成及其排列顺序。海洋生物是开发生物活性肽的良好资源，近年来人们已从海洋生物、海洋加工的副产物中提取出许多不同种类的生物活性肽。随着消费者在饮食与健康方面意识的提高，对功能性食品成分和保健营养品的认知和需求也逐渐增加，来源于海洋生物和海洋加工副产物的生物活性肽，因为其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强等优点在功能性食品的开发中极具潜力。血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓性疾病包括动脉血栓形成、静脉血栓形成、微血栓形成、血栓栓塞性疾病等。正常情况下体内凝血与抗凝血是处于一种动态平衡之中，当凝血异常形成血栓时，应用抗凝血药物抑制凝血以及使用溶栓药物增强纤溶系统作用，这些是在疾病发生后采取措施纠正体内的失衡。其实从体内凝血状态异常到最终血栓形成引发疾病，其间有比较长的病理过程。通过对患者凝血状态指标变化的监测中获得疾病发生发展的信息，就可以早期预防血栓的形成，对己经发生血栓者的治疗预后也可以做出指导和评估。血栓性疾病严重危害中老年人的健康，近年来随着生活节奏的加快，血栓性疾病患者数量明显增加，因而人们越来越关注血栓的预防及其治疗。凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性血栓严重危害着人类健康。当前，心脑血管血栓性疾病发病率逐年上升。为了预防血栓形成或阻止己形成血栓的发展，均应使用抗凝血药物。抗血液凝集机制为加入的物质可阻止凝血酶原形成凝血酶，从而抑制纤维蛋白原向纤维蛋白的转化；纤维蛋白溶解机理是通过加入纤溶酶原激活物激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶诱导纤维蛋白转化为纤维蛋白降解产物；抗血小板聚集机理是通过加入杭血小板聚集物质减少附着存纤维蛋白骨架上的血小板。抗凝血药通常都是通过对凝血过程中某一关键的凝血因子(如组织因子、因子X和凝血酶)的抑制作用而阻断凝血过程的进行。临床上抗凝血药物大多围绕对凝血酶及其他凝血因子的抑制而达到抗凝血作用。二十一世纪是海洋的世纪，海洋是未来食品、药品和保健品的主要原料基地。开发海洋，充分利用海洋资源是当今科技发展的重要方向。贻贝作为一种海洋资源，集高蛋白、保健、防病于一体具有很高的食疗与药用功效。因适应性强，产量高等特点，容易大量人工繁殖。不仅蛋白质含量高，氨基酸模式更接近人体需要。经酶解处理可以释放出具有各种活性多肽。目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3种：溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。由于酶水解法没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为食品和制药工业的首选方法。酶法制备生物活性肽是通过适当的蛋白酶水解蛋白来制备生物活性肽的一种方法。将具有抗凝血效果的生物活性肽用于预防血栓形成、溶栓治疗和介入治疗后的维护治疗具有广阔的应用前景。主要是采用合成方法制备抗凝血肽和从生物分泌物中提取抗凝血肽。目前国内外临床使用的主要抗凝血药物是普通肝素、低分子肝素、华法林等，这些药物存在导致血小板减少、出血等副作用或起效较慢等缺点。而多肽类抗凝血药物具有起效快、副作用较低等突出优点，是今后抗凝血药的重点发展方向。Sarmientos从水蛭中分离得到抗凝血多肽。Lu等从蝎子毒液中提取到活性肽（scorpionvenompeptides,SVP），SVP能抑制老鼠血小板聚集和血栓形成，并能提高溶纤活性。Barbouche等从毒蛇Viperalebetina的毒液中分离得到Lebetins1和Lebetins2两组多肽，它们能抑制血小板的凝聚。但是它们也都存在一些问题，由于它们是从水蛙的唾液或者毒蛇、蝎子的毒液中得到，它们本身就是水蛙的唾液或者毒蛇、蝎子的毒液的有效成分，所以它具有这些物质的副作用，如引起大面积出血。来源于食品的抗凝血活性肽，由于其来源于食品，它在人的肠胃内可能就被消化且吸收，在人体的抗凝系统中发挥作用，如Hartmann从新生儿血清中分离得到肠胃消化K-酪蛋白C-端部分产生的具有抑制血小板聚集和抑制纤维蛋白原结合到血小板表面受体上具活性的肽片段。因此可以预见来源于食品的抗凝血肽安全性高。而目前从食品原料通过酶解得到抗凝血效果的生物活性肽的研究鲜见报道，分析原因是没有找到合适的酶解底物，二是从事医学研究的科研人员更重视溶栓药物的开发。从一定程度上讲，预防血栓的发生比发生血栓后溶栓治疗更有意义。研究贻贝蛋白水解物的抗凝血酶活性，从而开发出一种具有抗凝血活性的功能性成分应用到保健食品和药品中，有广阔应用前景。抗凝血肽作为一种清除血栓的药物在已被广泛应用于医药领域，目前市场上的抗凝血药物提取率低，副作用大，或价格昂贵。技术实现要素：本发明从上述影响抗凝血活性的机理及目前存在的问题入手，最大程度的保留贻贝中的抗凝血肽，并将其浓缩富集。本发明旨在选用不同种类的蛋白酶水解食源性的贻贝蛋白，即采用定向酶水解技术，制备具有抗凝血活性的多肽粉末，并对活性肽进行提纯浓缩，该法条件温和，成本低，副产物少，活性高。相对于化学合成或其他来源的抗凝血药物，该产品消化吸收性强，不会对人体产生副作用，对凝血有较强的预防作用。本发明的技术方案是这样实现的：一种具有抗血栓活性的贻贝多肽的制备方法，其步骤如下：（1）前处理：新鲜市售贻贝自来水冲洗三遍，去除杂质及盐分。（2）匀浆：将冲洗干净的贻贝去壳，将贝肉剪碎，加3-10倍体积去离子水混匀后用匀浆机进行匀浆处理（5000-8000rpm，5-10min），得到贻贝匀浆液。（3）酶解：选用胰蛋白酶、中性蛋白酶分别对贻贝匀浆液进行酶解，酶解过程中以0.5mo1/LNaOH溶液调节体系pH值并维持其稳定。酶解条件按表1操作。表1：酶解条件酶种类温度/℃pH酶解时间/min加酶量/(u/g)胰蛋白酶25-557.0~9.020-1801000~5000中性蛋白酶30-506.5~8.520-1801000~5000（4）灭酶、离心：将酶解液置于95-100℃水浴锅中加热8-15min使酶失活，待冷却至室温后离心（5000-10000rpm，10-30min），得酶解多肽上清液。（5）超滤：采用1000-3000Da的滤膜对酶解液进行膜截留，保留流出液部分，即可获得分子量低于1000Da-3000Da的多肽液体。（6）序列鉴定：将超滤多肽用MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)确定其分子量分布，并采用Q-Tof测定其多肽序列。（7）抗凝血活性确定酶水解物抗凝血肽与凝血酶标准品反应混合，用酶标仪测定不同酶解条件下OD值，计算出多肽的凝血酶抑制率，以此为指标分析其抗凝效果。（8）浓缩、干燥：蒸发浓缩的方式进行喷雾干燥前的产品浓缩操作，可以采用单效蒸发也可采用多效蒸发，以固形物在20%-45%之间为宜。将浓缩后的液体由进料泵匀速送入喷雾干燥塔内进行喷雾干燥，此时出风温度为75℃-85℃，进风温度为138℃-146℃，进料速度的控制工作电压为44V-70V；将喷雾干燥处理后的产品送入多级旋风分离器进行气粉分离，将气粉分离后的产品在配有除湿器的恒温干燥室内收集得成品粉末。也可进行冷冻干燥，浆料厚度为3mm-7mm，工艺条件为：工作压力35-80Pa、冷冻温度-10℃--30℃、冷冻时间5h-12h、升华温度10-50℃、解析温度10-50℃，制得干燥物。将干燥物用真空冷冻干燥粉碎机进行粉碎，过60目-80目筛，所得粉末即为干燥的贻贝抗凝血活性肽粉末，低温干燥保存。本发明的有益效果为:（1）以贻贝为原料开发抗凝血肽的技术，目前并未见相关专利文献，本发明所述的酶解制备方法有效填补该领域空白，经鉴定，根据本发明所述酶解制备方法制备的抗凝血活性肽不同于目前报道的同类产品。（2）采用定向酶解技术，对肽段的切割位点把握更为精准，有利于活性肽的分离及活性鉴定。酶解后的贻贝多肽液抗凝血活性较高，该1mg抗凝血贻贝多肽粉的抗凝血酶活性单位为90ATU/mg——150ATU/mg。（3）采用贻贝作为原料，来源广泛，价格低廉，可进行地、中、高规模化工业化生产，满足各种规格工厂的加工需要，对贻贝产品的深加工及其在功能性食品、保健食品或药品中的开发利用具有重要的指导性意义。（4）将获得的具有较高抗凝血活性的多肽进行富集浓缩及干燥成粉，提升抗凝血活性的同时便于储存，并且该产品粉末具有显著抗凝血活性。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。1）前处理：新鲜市售贻贝自来水冲洗三遍，去除杂质及盐分。2）匀浆：将冲洗干净的贻贝去壳，将贝肉剪碎，加3-10倍体积去离子水混匀后用匀浆机进行匀浆处理（5000-8000rpm，5-10min），得到贻贝匀浆液。3）酶解：选用胰蛋白酶、中性蛋白酶分别对贻贝匀浆液进行酶解，酶解过程中以0.5mo1/LNaOH溶液调节体系pH值并维持其稳定。酶解条件按表1操作。表1：酶解条件酶种类温度/℃pH酶解时间/min加酶量/(u/g)胰蛋白酶25-557.0~9.020-1801000~5000中性蛋白酶30-506.5~8.520-1801000~5000（4）灭酶、离心：将酶解液置于95-100℃水浴锅中加热8-15min使酶失活，待冷却至室温后离心（5000-10000rpm，10-30min），得酶解多肽上清液。（5）超滤：采用1000-3000Da的滤膜对酶解液进行膜截留，保留流出液部分，即可获得分子量低于1000Da-3000Da的多肽液体。（6）抗凝血活性确定酶水解物抗凝血肽与凝血酶标准品反应混合，用酶标仪测定不同酶解条件下OD值，计算出多肽的凝血酶抑制率，以此为指标分析其抗凝效果。（7）浓缩、干燥：蒸发浓缩的方式进行喷雾干燥前的产品浓缩操作，可以采用单效蒸发也可采用多效蒸发，以固形物在20%-45%之间为宜。将浓缩后的液体由进料泵匀速送入喷雾干燥塔内进行喷雾干燥，此时出风温度为75℃-85℃，进风温度为138℃-146℃，进料速度的控制工作电压为44V-70V；将喷雾干燥处理后的产品送入多级旋风分离器进行气粉分离，将气粉分离后的产品在配有除湿器的恒温干燥室内收集得成品粉末。本发明所得到的贻贝蛋白抗凝血活性肽粉具有显著抗凝血活性的特点，相关的研究方法如下：（1）多肽含量的测定采用BCA方法对最终多肽混合物粉末进行测定。具体操作步骤如下：配制标准品和工作液：A.梯度稀释牛血清蛋白（BSA）标准品B.按实验所需工作液的体积，将BCA试剂盒中的A液与B液按照50:1的比例进行混合。室温下贮存。蛋白含量测定a.取25μL已稀释的梯度浓度的BSA和待测蛋白质样品，加入到96孔板中。b.每个试管中加入200μL工作液，使其充分混匀。c.密封96孔板，置于37℃培养箱中孵育30min。d.将96孔板冷却至室温。使用酶标仪测量在波长562nm处样品的吸光值。数据分析：以在波长562nm处BSA标准品的吸光值为纵坐标，BSA标准品浓度为横坐标，制作标准曲线，以此计算待测样品蛋白质的浓度。（2）抗凝血活性（凝血酶抑制率）测定方法采用酶标仪法，设置酶标仪温度为37℃，测定波长405nm。纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液均以Tris-HCl缓冲液(0.05mo1/L,pH=7.4)配制。向酶标板中加入140μL1mg/ml(W/V)纤维蛋自原溶液和40μL样品溶液，混匀后读数(ASB)。再加入10μL凝血酶溶液(12U/mL)开始反应，37℃预热10min后读数(AS)。取40μLTris-HCL缓冲液代替样品溶液，其他操作同样品管，测得吸光值(ACB）和AC。定义凝血酶抑制活性为每毫克贻贝蛋白的抗凝血酶活力，单位：ATU/mg。凝血酶抑制活性=Ce*Y*Ve/(Ch*Vh*m)Ve——标准凝血酶加样体积/微升Ce——标准凝血酶活性U/mlY——抑制率%Ch——样品浓度，mg/mlVh——样品加样体积/微升m——贻贝蛋白含量，mgY=[(AC-ACB)-(AS-ASB)]/(AC-ACB)*100%(3)水解度测定方法采用pH-stat法测定贻贝蛋白的水解度，加入蛋白酶后开始计时，在水解过程中加入0.5mol/L的NaOH维持pH恒定，每20min记录一次耗碱量，直到水解结束。通过下式计算水解度。DH(%)=VNaOH*NNaOH/(α*Mp*Htot)*100式中：a=10pH-pK/(1+10pH-pK)pK=7.8+2400*(298-t)/298TT=273.15+tVNaOH：滴定消耗的碱体积（mL）C：滴定消耗的碱当量浓度（mol/L）Mp：蛋白质质量(g)α：α-氨基的平均解离度t：反应环境的温度（4）水分测定方法根据GB50093-2010中的水分测定方法进行测定：①实验前将铝称量瓶、离心管在105℃烘箱中干燥过夜，称重前在干燥器中冷却1-2h，称量瓶的重量记为m1。②向匀浆机中加入100mL提前预热到30℃的去离子水，再加入3滴消泡剂，然后将4g（精确至0.001g）样品加入其中，将搅拌器转速慢慢调节到1500rpm，搅拌10min。③立刻取5mL混合液于三个铝称量瓶中，称重记为m2。将其放入105℃烘箱中直至恒重，称重记为m3。按下列公式进行计算：水分含量M%=（m3-m1）/（m2-m1）×100%（5）蛋白质测定方法采用自动凯氏定氮仪法进行测定。称取0.2g贻贝，精确至0.001g。按照仪器说明书的要求进行检测。计算的时候氮的换算为蛋白质的系数为6.25。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字。经上述检测得到本产品贻贝抗凝血活性多肽粉的基本成分为：总蛋白含量≥60%，其中小于1000-3000Da的多肽含量大于50%、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解液水解2小时的水解度分别为15.67%和12.76%、灰分0.1%-0.5、水分≤4%。经检测1mg贻贝胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解液干粉的抗凝血酶活性单位分别为135.63ATU/mg和91.44ATU/mg。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3