本发明属于成肌细胞的分化培养，涉及一种C2C12成肌细胞分化培养的方法。
背景技术：
C2C12是小鼠的成肌细胞，分化比较快，可形成具有收缩性的肌管，产生特征性的肌蛋白。因此，在各种医学研究中应用广泛，如生物医学、肌肉再生的临床研究等。成肌细胞分化的研究对理解肌肉细胞发育和修复 （ 再生） 是非常重要的。 培养中的成肌细胞可以表现出肌肉发生过程的特征，包括增殖，迁移，融合，肌管形成和收缩。 生长于含有 10％胎牛血清培养基中的肌肉细胞即使汇合了，也继续增殖 ；而当它们生长于含2-5％马血清的培养基中时，却发生融合并形成肌管。小鼠细胞系 C2C12是广泛用来研究成肌细胞增殖和分化的细胞系。 目前的科研要求研究者从实验动物中分离和培养原代的成肌细胞。在研究中发现，采用 Rando 描述的方法来分离和分化新生小鼠的成肌细胞非常困难，成功率低。 随着实验步骤的增加，得到的成肌细胞越来越少，过程中丢失了很多成肌细胞和卫星细胞，卫星细胞是成肌细胞分化所必需的，并且是成肌细胞的来源 ；少数存活下来的成肌细胞生长及其缓慢，非常容易发生凋亡。
申请公布号CN103881966A，发明名称：小鼠成肌细胞的制备方法及其应用，一种小鼠成肌细胞的制备方法，该方法包括下列步骤 ：A）将刚离体、并剪碎的小鼠腿部肌肉按体积比1：2 加入分散剂， 在37℃颠倒摇动5-10min，1000rpm 离心 5min，去上清，得组织碎片 ； B） 组织碎片中按体积比 1：2 加入分散剂，在 37℃上下颠倒摇动 5-10min 成浆糊状，按体积比 1 ：10 加入血清以终止酶消化 ； C）过滤 80μm 无菌尼龙网，去除大的组织碎片，滤液 1000rpm 离心 5min，去上清，得沉淀 ；D）沉淀置胶原蛋白包被的培养皿中，加原代成肌细胞生长培养基，在 37℃，5%CO2 的培养箱中培养 ； E）当成肌细胞生长到 40-80％丰度时，去生长培养基，加分化培养基，每天更换分化培养基持续培养成肌细胞，直至肌管被诱导形成。该方法能够分离到较多、较纯的小鼠成肌细胞和卫星细胞，从每克小鼠肌肉中能分离，到约 1×108 个细胞，其中成肌细胞和卫星细胞的比例达到 90％以上。分离到的细胞生长旺盛，能够在马血清的诱导下分化形成大量典型的肌管，数量是其它方法形成肌管的10倍以上。但是该方法分离得到的成肌细胞为原代成肌细胞，分离小鼠骨骼肌成肌细胞并传代超过 5 次后，在 2％马血清中将其诱导分化三天，只能形成少量的肌管。因此现有方法分离得到的原代成肌细胞传代4-5次以后，成肌细胞会丧失在体外形成肌管的能力，成肌细胞的增值和分化能力就会严重降低，采用上述方法分离的细胞没有办法长期传代保存利用。
技术实现要素：
本发明提供了一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，采用优化生长培养基和分化培养基的方法，使得实验室分离得到的原代C2C12成肌细胞可以多次传代培养，并且其增殖分化能力没有明显降低。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，包括以下步骤：
（1）取传代五次以上的C2C12成肌细胞接种于含有生长培养基的培养瓶中，置于 CO2孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；
（2）当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 PBS将细胞洗涤2次，再加入 1m L0.25%胰蛋白酶-EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入3m L生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入10m L离心管中，1000r/min离心5min，吸掉上清液，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按4000个/cm2铺于含有生长培养基的孔板内，置于 CO2孵箱内，占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；
（3）待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导其进行肌向分化，每48h 更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；
所述的生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8-10μg/升，EGF0.2-0.3mg/L，胰岛素100-200mg/L，地黄多糖30-50mg/L；
所述的分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，大豆苷原8-10μg/升，石榴提取物20-30mg/L，金银花提取物10-15mg/L。
优选地：所述的生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8μg/升，EGF0.3mg/L，胰岛素160mg/L，地黄多糖35mg/L。
优选地：所述的分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，大豆苷原10μg/升，石榴提取物30mg/L，金银花提取物13mg/L。
优选地：所述的冻存传代为预冷冻保存的细胞为生长良好且存活率高，密度80%～90%，冷冻一日前更换新鲜的完全培养基, 观察细胞的生长情形，依照细胞传代培养操作消化收集细胞, 离心, 去除上清液, 加入完全培养基和 DMSO( 比例9: 1) , 混合均匀, 分装于冷冻保存管, 1m L/vial, 并取少量细胞悬浮液做污染检测，冷冻管置于 4℃ 10min, - 20℃ 30min,- 80℃ 16～18h, 最后放于液氮罐中长期保存。
优选地：所述的牛蒡子苷的制备方法为：牛蒡子药材粉碎至40-50目，加8-10倍的水，回流提取两次，每次1-2h；合并滤液，滤液过滤，然后上D101树脂吸附洗脱，洗脱依次用2倍树脂体积的水、20%乙醇和50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，然后浓缩除去乙醇，浓缩后加入0.5%的活性炭煮沸30min，离心去除活性炭， 0～4度静置过夜，过滤干燥 ，即得。
优选地：所述的地黄多糖得制备方法为：熟地黄粉碎至40-50目的颗粒，石油醚脱脂，80％的乙醇脱单糖、低聚糖，药渣加热挥发完溶剂，然后按照料液比1g：60ml，纤维素酶3％，调节pH为4.0，充分搅拌，在40℃下酶解2小时，然后超声波提取：超声频率为40KW，提取时间3mi ，离心分离，转速5000r/min，离心30分钟，取滤液,在滤液中加入85％乙醇溶液，并用碳酸氢铵调节pH为8.0，沉淀多糖，收集沉淀；对收集的沉淀进行减压蒸馏，得到地黄多糖。
优选地：所述的石榴提取物的制备方法为：酸石榴表面洗净擦干，手工去皮、剥出籽粒，用手工榨汁机取汁，混匀后，用孔径0.1 mm滤布过滤，4 000 r／min离心10min，收集上层石榴汁清液，调整滤液的pH为2.0，用AB-8树脂吸附，用70%的乙醇解吸，收集解吸液，浓缩干燥，既得石榴提取物。
优选地：所述的金银花提取物的制备方法为：金银花粉碎至50-80目，然后按照料液比1g：10ml加入70%的乙醇回流提取两次，每次1h，合并滤液，减压浓度除去乙醇，将浓缩液的pH值调至1.8-2.2，以4倍量的乙酸乙酯分4次萃取， 合并萃取液，用适量水洗涤1-2次以质量分数为 50% 的氢氧化钠溶液调pH值调为6-7，分离取水层，然后用D-101大孔树脂纯化，洗脱用70%乙醇，收集洗脱液，减压浓缩干燥，既得金银花提取物。
本发明的有益效果：
本发明的培养方法通过优化生长培养基和分化培养基的方法，在生长培养基的里面增加存进C2C12成肌细胞增殖的成分，如牛蒡子苷、EGF（表皮生长因子）、胰岛素和地黄多糖，它们可以有效的存进细胞的增殖，并且牛蒡子苷在促进细胞增殖的同时，还可以存进细胞的分化，在生长培养基中添加微量牛蒡子苷，可以使细胞增殖的过程中，保持分化的活力，可以有效的存进细胞的分化。在分化培养基中增加存进细胞分化的成分，如大豆苷原、石榴提取物和金银花提取物，它们可以有效的存进细胞的分化，并且在分化的同时保持细胞的活力，使其分化效果更好。通过本发明的培养方法，传代五次以上的成肌细胞，85%以上的细胞可以分化肌管，可以有效的提高分离得到的原代成肌细胞的利用率。
细胞培养对营养成分的要求很高，因此我们添加的促进增殖分析的成分都是通过一些特殊制备方法得到的产品，可以有效的避免添加营养成分对于细胞增殖分化的影响，提高其稳定性，有利于成肌细胞的传代分化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-3和对比例1的细胞分化图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所采用的C2C12成肌细胞为采用申请公布号CN103881966A的方法分离得到的小鼠成肌细胞，具体分离方法参考该专利方法。分离得到的原代小鼠成肌细胞接种于含有生长培养基的培养瓶中，置于 CO2孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜，当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 PBS将细胞洗涤2次，再加入 1m L0.25%胰蛋白酶-EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶或者加入1m L完全培养基终止消化，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入3m L生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入10m L离心管中，1000rpm离心5min，吸掉上清液， 加入完全培养基和 DMSO( 比例9: 1) , 混合均匀, 分装于冷冻保存管, 1m L/vial, 冷冻管置于 4℃ 10min, - 20℃ 30min,- 80℃ 16～18h, 最后放于液氮罐中长期保存。
需要传代培养的成肌细胞吸掉上清液，加入生长培养基，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液吸出分装至培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖，倒置显微镜下观察细胞量，传代细胞的密度应该不低于5×105 /ml，即完成小鼠成肌细胞的第一次传代。
牛蒡子苷的制备方法为：牛蒡子药材粉碎至40-50目，加10倍的水，回流提取两次，每次2h；合并滤液，滤液过滤，然后上D101树脂吸附洗脱，洗脱依次用2倍树脂体积的水、20%乙醇和50%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱液，然后浓缩除去乙醇，浓缩后加入0.5%的活性炭煮沸30min，离心去除活性炭 ， 0～4度静置过夜，过滤干燥 ，即得。
地黄多糖得制备方法为：熟地黄粉碎至40-50目的颗粒，石油醚脱脂，用80％的乙醇脱单糖、低聚糖，药渣加热挥发完溶剂，然后按照料液比1：60，纤维素酶3％，调节pH为4.0，充分搅拌，在40℃下酶解2小时，然后超声波提取：超声频率40KW，提取时间3min ，离心分离，转速5000r/min，离心30分钟，取滤液，在滤液中加入85％乙醇溶液，并用碳酸氢铵调节pH为8.0，沉淀多糖，收集沉淀，对收集的沉淀进行减压蒸馏，得到地黄多糖。
石榴提取物的制备方法为：酸石榴表面洗净擦干，手工去皮、剥出籽粒，用手工榨汁机取汁，混匀后，用孔径0.1mm滤布过滤，4 000 r／min离心10min，收集上层石榴汁清液，调整滤液的pH为2.0，用AB-8树脂吸附，用70%的乙醇解吸，收集解吸液，浓缩干燥，既得石榴提取物。
金银花提取物的制备方法为：金银花粉碎至50-80目，然后按照料液比1g：10ml加入70%的乙醇回流提取两次，每次1h，合并滤液，减压浓度除去乙醇，将浓缩液的pH值调至2， 以4倍量的乙酸乙酯分4次萃取， 合并萃取液，用适量水洗涤2次，以质量分数为 50% 的氢氧化钠溶液调pH值调为7，分离取水层，然后用D-101大孔树脂纯化，洗脱用70%乙醇，收集洗脱液，减压浓缩干燥，既得金银花提取物。
实施例1
一种C2C12成肌细胞分化培养的方法，包括以下步骤：
（1）从按照上面的传代方法，取连续传代C2C12成肌细胞，接种于含有生长培养基的培养瓶中，置于 CO2孵箱中培养，孵箱条件为占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；
（2）当细胞生长到对数期时，弃去旧培养基，用 PBS将细胞洗涤2次，再加入 1m L0.25%胰蛋白酶-EDTA，覆盖细胞，在倒置显微镜下可观察到细胞消化的情况，当细胞将要分离呈现圆形时，吸去胰酶终止消化，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入3m L生长培养基，用吸管轻轻吹打数次以打散细胞团块，吸出细胞悬液，放入10m L离心管中，1000rpm离心5min，吸掉上清液，加入适量新鲜生长培养基，用吸管吹打均匀后，按4000个/cm2铺于含有生长培养基的孔板内，置于 CO2孵箱内，占体积分数 95%空气，5%CO2，温度为37℃，每 48h换液，细胞形态观察使用倒置显微镜；
（3）待细胞生长至 80%汇合时，撤出生长培养基，加入分化培养基中诱导其进行肌向分化，每48h 更换分化培养液，观察细胞形态使用倒置显微镜；
生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷8μg/升，EGF0.3mg/L，胰岛素160mg/L，地黄多糖35mg/L。
分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，大豆苷原10μg/升，石榴提取物30mg/L，金银花提取物13mg/L。
传代五次的小鼠成肌细胞，接种于生长培养基，显微镜观察， 2天以后，显微镜下可见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长由85%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞，一天半以后有小的肌管形成，如图1所示， 五天以后90％以上培养的细胞分化成成熟的肌管。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处在于：采用连续传代6次的小鼠成肌细胞，生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷9μg/升，EGF0.2mg/L，胰岛素100mg/L，地黄多糖50mg/L。
分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，大豆苷原8μg/升，石榴提取物20mg/L，金银花提取物10mg/L。
传代6次的小鼠成肌细胞，接种于生长培养基，显微镜观察， 2天以后，显微镜下可见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长由80%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞，一天半以后有小的肌管形成，如图1所示，五天以后85％以上培养的细胞分化成成熟的肌管。
实施例3
与实施例1基本相同，不同之处在于：采用连续传代8次的小鼠成肌细胞，生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗，牛蒡子苷10μg/升，EGF0.25mg/L，胰岛素200mg/L，地黄多糖30mg/L。
分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗，大豆苷原9μg/升，石榴提取物25mg/L，金银花提取物15mg/L。
传代8次的小鼠成肌细胞，接种于生长培养基，显微镜观察，3天以后，显微镜下可见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长由80%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞，一天半以后有小的肌管形成，如图1所示，五天以后80％以上培养的细胞分化成成熟的肌管。
对比例1
与实施例1基本相同，不同之处在于：生长培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 10%胎牛血清，1%双抗。
分化培养基为以高糖 DMEM 培养基为基液，含有 2%马血清，1%双抗。
传代五次的小鼠成肌细胞，接种于生长培养基，显微镜观察，5天以后，显微镜下可见梭形、折光性好的透亮细胞，细胞生长为60%汇合，接种于分化培养基的小鼠成肌细胞，三天以后有小的肌管形成，如图1所示，五天以后30％培养的细胞分化成成熟的肌管。
由以上的实施例可知，本发明的培养方法可以有效的提高传代次数超过5次的小鼠成肌细胞的增殖和分化，极大地提高了分离得到的小鼠成肌细胞的利用率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。