一种猴胚胎干细胞的无血清培养基的制作方法

本发明涉及干细胞培养领域，特别涉及一种猴胚胎干细胞的无血清培养基。

背景技术：

胚胎干细胞(Embryonic Stem cell,ESC)是从早期胚胎的内细胞团(Inner Cell Mass,ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出的、能在体外培养的一种高度未分化的细胞，其可分化为3个胚层来源的各种组织和细胞类型的永久细胞系。目前普遍认为，胚胎干细胞对体外研究动物和人的胚胎发生发育、新基因发现、药物筛选等领域将产生重要的影响。

尽管人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)在再生医学、药物筛选和发育生物学等领域具有重要的研究和应用价值，但人胚胎干细胞及初胚的使用主要涉及到道德伦理问题。至今很多国家已制订法律或者法规明令禁止克隆人的研究，使用人胚胎干细胞株前仍需要经过严格的审查批准，很多实验无法真正在人体内开展，如四倍体嵌合等体内发育方面的实验，这就需要在非人灵长类动物模型体内首先进行实验。非人灵长类是和人类亲缘性最近的模式动物，可以很好地模拟人体内情况，胚胎干细胞在进行临床应用之前，在非人灵长类动物模型体内的临床前研究是必不可少的。即开展非人灵长类动物胚胎干细胞研究具有重要的理论意义和比较医学价值。

建立一个理想的非人灵长类胚胎干细胞培养体系是利用它的前提。非人灵长类胚胎干细胞来源主要是猕猴、食蟹猴、恒河猴、绒猴等。猴的胚胎干细胞(monkey embryonic stem cells,mESC)形态类似人胚胎干细胞形态，成单层扁平克隆样生长，胚胎干细胞个小，核质比大，排列致密，边界光滑，和周围饲养层细胞分界明显。目前猴胚胎干细胞的培养方式主要借鉴于人胚胎干细胞的培养方式，培养基也和人胚胎干细胞培养基一致，但和人胚胎干细胞相比，猴胚胎干细胞更容易分化。这可能和猴胚胎干细胞的培养体系尚不成熟有关，尤其是在无饲养层体系培养中。目前市场上无血清培养基主要是针对人胚胎干细胞的培养，还没有一种商品化培养基能较长时间内维持猴胚胎干细胞的未分化状态和全能性。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

为了解决猴胚胎干细胞难培养的问题，本发明的目的是提供一种猴胚胎干细胞的无血清培养基，该培养基能在较长时间内维持猴胚胎干细胞的未分化状态和全能性，其既适合在无饲养层体系中培养猴胚胎干细胞，也适合在饲养层体系中培养猴胚胎干细胞。

为了实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种猴胚胎干细胞的无血清培养基，包括基础培养基和溶解在基础培养基中的添加物，其中：所述基础培养基包括DMEM-F12培养基，所述添加物包括的组分及各组分在所述基础培养基中的浓度如下：

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所述添加物包括的组分及各组分在所述基础培养基中的浓度如下：

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所述猴胚胎干细胞可选的为猕猴胚胎干细胞、食蟹猴胚胎干细胞、恒河猴胚胎干细胞或绒猴胚胎干细胞。

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所述非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸中的一种或多种。

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所述添加物还包括丙酮酸钠和血小板衍生因子-BB(即PDGF-BB)，其中：所述丙酮酸钠在基础培养基中的浓度为1-5mM，所述血小板衍生因子-BB在基础培养基中的浓度为1-10ng/ml。

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所述丙酮酸钠在基础培养基中的浓度为1mM，所述血小板衍生因子-BB在基础培养基中的浓度为10ng/ml。

上述猴胚胎干细胞的无血清培养基在另一种实施方式中，所含各种蛋白质和各种生长因子皆来自人源。

本发明还提供了上述无血清培养基在猴胚胎干细胞培养中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、使用本发明无血清培养基在体外培养猴胚胎干细胞，不仅可以维持猴胚胎干细胞的自我更新，并且能在较长时间内维持猴胚胎干细胞的未分化状态和全能性。

2、本发明无血清培养基不仅适合在无饲养层体系培养猴胚胎干细胞，也适合在饲养层体系培养，从而有利于饲养层体系向无饲养层体系转变。

3、本发明无血清培养基排除了动物来源的病原体污染的可能性，并且成分确定，因此可以保证在体外培养的猴胚胎干细胞的安全性，所获得的干细胞可用于干细胞临床治疗研究中。

附图说明

图1为实施例2在饲养层体系培养获得的猕猴胚胎干细胞形态图。

图2为实施例3在无饲养层体系培养获得的猕猴胚胎干细胞形态图。

图3为实施例4中连续培养猕猴胚胎干细胞15代后核型分析结果。

图4为实施例5中连续培养猕猴胚胎干细胞15代后EB球形成。

图5为实施例6中连续培养猕猴胚胎干细胞15代后注入小鼠，获取脐胎瘤切片，进行HE染色的图片。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1、培养基的配制

本实施例提供了一种猴胚胎干细胞的无血清培养基，其以DMEM-F12为基础培养基，并向基础培养基中添加以下添加物组分，各添加物组分在基础培养基中的浓度也如下所示：

其中非必需氨基酸由等浓度的丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸组成。

本实施例中使用的细胞培养试剂和细胞因子厂家和货号见下表：

上述配好的完全培养基用0.22μm的滤器过滤除菌，-20℃避光保存。

上述培养基各参数如下：

pH:7.4

渗透压:340mosm

细菌、真菌检测:阴性

衣原体、支原体检测:阴性

内毒素:<0.5EU/mL

实施例2、猕猴胚胎干细胞系在饲养层体系中的培养

1、试验材料：猕猴胚胎干细胞系。

2、试验方法：将试验材料分为试验组和对照组，其中：

试验组：将P25代猕猴胚胎干细胞按5×10⁴/well的密度种植到预先铺好饲养层细胞的6孔板中，所述饲养层细胞是小鼠胚胎成纤维细胞经10μg/ml丝裂酶素-C处理2-2.5小时后所得的单层细胞，并向6孔板的孔中加入实施例1所得的猴胚胎干细胞无血清培养基置于37℃，5％CO₂培养箱中进行连续培养，每天更换一次培养基，大约5天继代培养一次。继代培养时采用Collagenase IV消化3min，用无菌玻璃吸管将猕猴胚胎干细胞集落切割成大小合适、均匀的小块，然后按1:5的比例继代培养。

对照组：方法同试验组，将试验组中所使用的猴胚胎干细胞无血清培养基换成培养人胚胎干细胞(hES/iPS)的无血清培养基(厂家：赛贝生物货号：CA1001500)。

3、实验结果：如图1所示，图1表明使用本发明培养基培养的猕猴胚胎干细胞的核质比大，排列致密，边界光滑，和周围饲养层细胞分界明显，并且能稳定传代下去。用对照组培养基培养的猕猴胚胎干细胞排列疏散，细胞边界不易分清，随着传代次数增加细胞严重分化。

实施例3、猕猴胚胎干细胞系在无饲养层体系中的培养

1、试验材料：猕猴胚胎干细胞系。

2、试验方法：将试验材料分为试验组和对照组，其中：

试验组：将P25代猕猴胚胎干细胞按5×10⁴/well的密度种植到预先用Matrigel包被过夜的6孔板中，并加入实施例1所得的猴胚胎干细胞无血清培养基置于37℃，5％CO₂培养箱进行连续培养，每天更换一次培养基，大约5天继代培养一次。继代培养采用EDTA消化3min，用1mL枪轻轻吹打猕猴胚胎干细胞系克隆为均匀的小块，然后按1:5的比例继代培养。

对照组：方法同试验组，将试验组中所使用的猴胚胎干细胞无血清培养基换成培养人胚胎干细胞(ES/iPS)的无血清培养基(厂家：赛贝生物货号：CA1001500)。

3、试验结果：如图2所示，图2表明使用本发明的无血清培养基进行扩增的猴胚胎干细胞呈克隆集落样生长，与对照组相比，试验组所获得的猴胚胎干细胞的形态更加均一，排列致密，细胞生长更加旺盛，随着传代次数增加能较好的维持mESC的未分化状态。

实施例4：猕猴胚胎干细胞的核型检测

(1)按照实施例3中的方法将P25代猕猴胚胎干细胞连续培养到P40代时，在mES细胞培养液中加入20μg/mL秋水仙素至其终浓度为0.1μg/mL，处理2～4h。

(2)将细胞消化转移至15mL离心管，1000r/min离心10min，弃上清。细胞沉淀中加入事先预热至37℃的0.56％KCl低渗液4mL，用滴管吹打成单细胞悬液，37℃低渗处理15～20min。

(3)加入1mL预冷的固定液，轻轻吹匀后1000r/min离心10min。弃上清，再加4mL新鲜预冷的固定液，轻轻吹打成单细胞悬液，放入4℃冰箱固定30min以上。1000r/min离心10min。

(4)重复第(3)步两次。弃上清，加入少量固定液(0.2～0.6mL)重悬细胞。

(5)取一洁净载片，用滴管吸取细胞悬液于载片垂直上方50cm以上处滴片，将载片倾斜放置，自然晾干(1h以上)。

(6)用Giemsa染液对载片在室温下染色1h后，用自来水冲洗、自然晾干。

(7)显微镜下观察、计数，结果如图3所示：图3表明猕猴胚胎干细胞在本发明的培养基中连续培养15代后仍保持正常的核型,其染色体数目与正常猕猴的一样，均为42条。

实施例5：拟胚体(Embryroid body，EB)的形成

EB的形成实验是用来检测多能性细胞的分化能力。按照实施例3中的方法将P25代猕猴胚胎干细胞连续培养到P40代时，用Collagenase IV把6孔板的mESC克隆消化成小块(比传代的块稍大)，1000r/min，3min离心后弃上清后种到一个T25培养瓶，T25培养瓶加5-6mL不加bFGF的培养液(该培养液的组成为：DMEM-F12培养基+20％Knock out SR+1mM NEAA)，第2天进行换液，4-5天后就可发现EB形成。

拟胚体(Embryroid body，EB)的形成结果如图4所示：图4表明mESC在本发明的培养基中连续培养15代后，将细胞悬浮培养4日后，可以观察到悬浮培养的EB，形成的EB球边界光滑，折光性好，说明了用本发明的无血清培养基培养mESC 15代后仍具有多能性细胞分化能力。

实施例6：畸胎瘤形成和成瘤后HE染色

按照实施例3中的方法将P25代猕猴胚胎干细胞连续培养到P40代时，消化成单细胞悬液，取同性别的免疫缺陷小鼠，腹股沟注射细胞悬液，每只鼠注射1×10⁷个细胞。饲养小鼠，两周后可见肿块。4～5周后处死小鼠，剥离肿块。固定，切片，染色，观察三胚层结构。畸胎瘤形成和成瘤后HE染色结果如图5所示：图5是用本发明的培养基培养的P40代猕猴胚胎干细胞系细胞注入免疫缺陷小鼠中，经过4-6周后可以形成具有不同胚层组织的畸胎瘤。说明经过本发明培养基扩增mES细胞维持了良好的体内分化潜能。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。