本发明涉及水产养殖，尤其是涉及一种对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
2003年以来，随着高密度养殖模式的推广，我国对虾养殖业进入高速发展时期，2006年，我国对虾养殖总量124万吨，占全球养殖对虾产量的39.2％，并连续多年保持世界第一。但是，集约化、高密度水产养殖的迅猛发展，使养殖生态环境遭到严重破坏，同时也产生了一系列负面的影响，包括饲料资源浪费，环境恶化、病害严重、种质退化、药物残留等，尤其是病害问题日趋严重。对虾白斑病毒、桃拉病毒以及弧菌病害等造成对虾大规模死亡，已成为制约对虾养殖业发展的重要瓶颈。自20世纪80年代起，在我国广东、福建、浙江和台湾等地区开始养殖，近年来，我国南方省区的凡纳滨对虾养殖规模迅速扩大，由传统的土塘养殖发展到高密度养殖的高位池、水泥池；在大规模的养殖环境下，带来水体环境的水质退化，各种病害也呈现迅速上升的势头。在每年的春未和夏季高温季节，经常暴发各种急性传染病，如神经坏死病毒、虹彩病毒、弧菌及其他病原细菌等造成虾苗及幼虾大批死亡，给养殖户带来巨大经济损失，严重制约了对虾养殖行业的发展。据统计，每年对虾苗的死亡率高达80％，目前，为了保持养殖密度以及防止对虾养殖过程中的疾病爆发，生产上盲目过度投放各类抗生素，如氯霉素，土霉素、呋喃唑酮等，从而造成养殖动物体内药物残留严重，给养殖动物和人类健康带来了潜在的危害。随着国家全面禁止在动物养殖中应用抗生素，开发无毒、无副作用、优质、新型的微生态制剂产品已成为当前市场的需要。
微生态制剂作的抗生素的替代品，一方面通过有益微生物降解养殖环境的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、饵料残渣、粪便排泄物等净化水质，为养殖动物营造一个良好的养殖环境，防止病原菌滋生；另一方面，通过有益微生物产生代谢产物和生理活性物质如抗菌肽等来抑制或者杀灭病原菌，同时提高养殖动物免疫力和抵抗力，达到防治病害的目的；再者有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢、提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的，在饲料中加入各种添加剂，可以促进凡纳滨对虾消化吸收，调节对虾肠道菌群稳定，提高凡纳滨免疫力和肠道增粗的作用。
本申请人在中国专利CN103387948A中公开一种沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用，涉及水产养殖。所述沙福芽孢杆菌Bacillus safensis 1A07588，已于2013年06月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2013290。分离自北冰洋加拿大海盆深海沉积物，可用于制备沙福芽孢杆菌制剂，所述沙福芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。所制备的沙福芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×109CFU/mL，最高可达到1×1010CFU/mL以上。促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。
本申请人在中国专利CN103497906A中公开一种微生态制剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。微生态制剂含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少一种和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；
枯草芽孢杆菌包括；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1A05680，保藏编号CCTCC NO:M 2013289；
短小芽孢杆菌包括：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO:M 2013291；
植物乳杆菌包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806，保藏编号CCTCC NO:M 2013293；
嗜酸乳杆菌包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO:M 2013294。
在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治病害，提高存活率，净化养殖水质制剂中应用。
本申请人在中国专利CN103387948A中公开一种沙福芽孢杆菌在对虾养殖中的应用，涉及水产养殖。所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588，保藏编号为CCTCC NO：M2013290，分离自北冰洋加拿大海盆深海沉积物，可用于制备沙福芽孢杆菌制剂，所述沙福芽孢杆菌制剂包括致病性弧菌抑菌制剂、对虾生长促进剂、对虾饲料添加剂、对虾养殖水质改良剂中的一种。所制备的沙福芽孢杆菌制剂包含的活菌数不低于1×109CFU/mL，最高可达到1×1010CFU/mL以上。促进对虾生长，提高对虾抗病力，减少对虾病害发生，特别是对于对虾弧菌病害的防治和对虾产量的增加具有很好的效果。
上述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7和沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号分别为：CCTCC NO:M 2013291、CCTCC NO:M 2013293、CCTCC NO:M 2013294、CCTCC NO：M 2013290。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂及其制备方法。
本发明的另一目的是提供所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的应用。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂含有：
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151中的至少一种，和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7中的至少一种；
所述沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588的保藏编号为CCTCC NO：M2013290；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151的保藏编号为CCTCC NO：M2013291；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806的保藏编号为CCTCC NO：M2013293；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7的保藏编号为CCTCC NO：M2013294。
当所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂包括：沙福芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌时，所述沙福芽孢杆菌含量占总菌数的百分比为10％～20％；所述短小芽孢杆菌含量占总菌数的百分比为10％～20％；所述植物乳杆菌含量占总菌数的百分比为30％～40％；所述嗜酸乳杆菌含量占总菌数的百分比为30％～40％，总量为100％。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的存在形式可为微生物菌体发酵液与固体辅料的混合物，或者微生物菌体与固体辅料的混合物。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的制备方法如下：
1)沙福芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基的配方(W/V)为：豆饼粉3％，淀粉1.5％，玉米浆1％，葡萄糖0.5％，(NH4)SO4 0.1％，KH2PO40.5％，NaH2PO4 0.5％，MgSO4 0.05％，MnSO4 0.05％，发酵条件为28～37℃，通气培养36～48h，活菌数≥109CFU/mL；
2)植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基：发酵培养基配方(W/V)：糖蜜3％，红糖1％，酵母粉0.6％，蛋白胨0.5％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.5％，发酵条件为28～37℃，静置培养36～48h，活菌数≥109CFU/mL；
当所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的存在形式为微生物菌液时，制备方法如下：
将沙福芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵液混合即可。
所述混合后可加入维生素C、低聚果糖、甘露醇等中的至少一种作为保护剂，起到协调保护作用，利于微生态制剂的保藏。
当所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的存在形式为微生物菌粉与固体辅料的混合物时，制备方法如下：
将沙福芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵液混合，并加入添加剂，所述添加剂可选自海藻糖、甘油、淀粉糊精、甘露醇、低聚果糖等中的至少一种，所述添加剂的加入量按质量百分比可为沙福芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵液混合液的1％～3％，经过浓缩冻干后作为主要活性成分，按要求的剂型工艺，添加固体辅料制成片剂、散剂、粉剂等中的一种。所述固体辅料为本技术领域常规使用的固体辅料，固体辅料可选自石灰石、硅藻土、沸石粉、活性碳、微量元素等。
本发明所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂中的上述任一组合，均具有促进凡纳滨对虾生长，提高对虾免疫力的抗病力，防治对虾病害尤其是对虾红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病等由弧菌引起的病害，增加摄食量，提高对虾存活率，净化养殖水质的作用。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂可在制备促进凡纳滨对虾生长，提高对虾免疫力和抗病力，防治对虾病害，提高存活率，净化养殖水质，尤其是对虾肠道增粗，对虾红腿病、烂眼病及对虾白斑病毒防治的制剂中的应用。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂可在制备兽药、饲料添加剂或水质净化剂等中应用。
所述兽药包括促进凡纳滨对虾生长、提高对虾免疫力和抗病力、防治对虾疾病、增加对虾摄食量、提高对虾存活率等药剂。所述对虾疾病包括红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病等。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂中，沙福芽孢杆菌发酵液、短小芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液均按照本领域常规的深层液体发酵培养的方式获得，经过斜面培养、一级种子培养和发酵培养。
本发明选用的菌株特性及功能如下：
1、沙福芽孢杆菌和短小芽孢杆菌：所述沙福芽孢杆菌CCTCC NO：M2013290和短小芽孢杆菌CCTCC NO：M2013291具有产胞外酶、脂肪酶、纤维素酶等活性，可以促进养殖动物生长，提高饲料利用率；同时能产生脂肽类抗菌物质，较强抑制众多水产动物致病菌，包括哈维氏弧菌、溶藻弧菌、坎贝氏弧菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌等。
2、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌：所述植物乳杆菌CCTCC NO：M2013293和嗜酸乳杆菌CCTCC NO：M2013294可以进入水产动物肠道，可以调节肠道菌群平衡，能产类细菌素和乳酸，抑制病原菌生长，提高养殖动物机体免疫力和抗病力。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂可促进对虾生长，提高对虾抗病力，防治对虾病害发生，提高对虾存活率，净化养殖水质。所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂应用于对虾养殖的使用方法和用量如下：
日常饲养时，取菌剂全池均匀泼洒。每5天使用一次，每亩养殖水体用量为1～2L，水质恶化时可加倍使用。使用后水质改善明显，水色鲜活、pH稳定、藻类生长稳定；同时水体弧菌含量较低，期间未见病害发生。同时取菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每100kg饲料使用1～2L,每日拌料投喂，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。拌料投喂一段时间后，对虾摄食旺盛、肠道粗实、未见肠炎等发生。
所述对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂可用于防治凡纳滨对虾养殖期间病害的发生，包括：红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病等症状；有效缓解或预防病害发生，极大地降低病害造成的死亡率；同时能改善养殖水质，增强凡纳滨对虾消化吸收功能和抗病能力，提高对虾产量和质量，缩短养殖周期。所述微生态制剂在防治凡纳滨对虾‘红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病’症状时的使用方法和用量如下：
凡纳滨对虾一旦出现红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病，立即使用菌剂。每亩水体用量为500～700ppm，全池均匀泼洒。每两天加一次微生态制剂，每次加菌之前池底清污，少量换水。2天为一个周期，连用6天，即可提高对虾免疫力，有效缓解对虾红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病等由弧菌引起的症状，极大提高存活率。
应用于凡纳滨对虾养殖的制剂，具体是由沙福芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌制成的制剂在促进凡纳滨对虾生长，提高免疫力和抗病力，防治对虾病害尤其是对虾红腿病、烂眼病、甲壳溃疡病等由弧菌引起的病害，增加摄食量提高凡纳滨对虾养殖存活率，降低养殖水体中的氨氮同时净化养殖水质中的应用。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
制备例说明：上述已经对本发明的对凡纳滨对虾养殖中抑制弧菌的微生态制剂的制备进行说明，通过沙福芽孢杆菌包括沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588，保藏编号CCTCC NO：M2013290；短小芽孢杆菌菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO：M2013291；植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806，保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO：M2013294共4种微生物的液体制剂为例进行说明。制备方法并不局限于本发明的实施例，公知的能够达成制备目的的方法均可以。以下实施例将对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。
包含沙福芽孢杆菌包括沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588，保藏编号CCTCC NO：M2013290；短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO：M2013291；植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806，保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO：M2013294，4种微生物已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
实施例1一种微生态制剂的制备
微生态制剂中各组分菌体的培养：
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)1A07588保藏编号CCTCC NO：M2013290和短小芽孢杆菌包括短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151保藏编号CCTCC NO：M2013291的培养：将出发菌株沙福芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的培养按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；发酵培养基配方(W/V)：豆饼粉3％，淀粉1.5％，玉米浆1％，葡萄糖0.5％，(NH4)SO4 0.1％，KH2PO4 0.5％，NaH2PO40.5％，MgSO4 0.05％，MnSO4 0.05％,发酵条件为28～37℃，通气培养36-48h，活菌数≥109CFU/mL；
植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基：发酵培养基配方(W/V)：糖蜜3％，红糖1％，酵母粉0.6％，蛋白胨0.5％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.5％，发酵条件为28-37℃，静置培养36～48h，活菌数≥109CFU/mL；
将上述制备的沙福芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌四个菌，按照各组分活菌数等比例混合均匀，混合菌液中添加维生素C(1g/L)得到复合微生态制剂菌液。
复合菌剂稳定性实验：
复合菌在温下避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测菌剂中的芽孢杆菌及乳酸菌含量。芽孢杆菌采LB平板稀释涂布法检测。乳酸菌采用MRS加2％碳酸钙稀释倒平板法检测，计数时只计算周围有溶钙圈的菌落。结果见表1：
表1
实施例2本发明的微生态制剂在对虾养殖中的应用试验1
一、材料与方法
1.试验产品：实施例1的复合微生态制剂菌液，总活菌数在10亿个/毫升以上。
2.试验对虾：将对虾分为2组，每组250尾，每组设3个重复。
3.试验水体：试验用水取自厦门白城砂滤海水。
4.试验场地：试验在半吨的玻璃纤维缸中开展。试验缸置于室外开阔处，自然条件下随机放置。
5.试验方法：试验周期45天，该试验采取对虾常规饲料喂养，试验组每吨饲料添加试验产品1kg，保证每克饲料中活菌数≥106CFU/mL，对照组不加试验品。在试验的第30天和第45天统计每组对虾的重量及存活情况。在试验的第45天，每个试验缸中留下50条对虾，余下取出。往每组试验水体中投加2×106CFU/mL的坎贝氏弧菌VH1进行致病性弧菌感染实验。
二、试验结果
1、对促进生长的影响
结果表明，试验组与对照相比，将体重提高10％，差别具有统计学意义(P<0.05)。
2、对存活率的影响
结果表明，试验组与对照组对虾存活率分别为89.9％和78.0％，试验线比对照组高近12％，差异具统计学意义(P<0.05)。
3、有益菌在肠道和水体中的存活情况。
通过检测对虾肠道以及养殖水体中肠乳酸杆菌和芽孢杆菌存活数发现，其中乳酸杆菌在肠道中的存活数高达6×105CFU/g，水体中检测到一定数量的乳酸杆菌(>500CFU/mL)；芽孢杆菌在肠道和水体中的存活数也都高于5×104CFU/g和1×104CFU/mL。
4、弧菌感染后对虾的存活情况
在试验的第45天，进行致病性弧菌感染实验。结果表明，经过5天的感染试验，对照组的对虾平均存活率为47％，而试验组对虾存活率高达92％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3本发明的微生态制剂在对虾虾苗养殖中的应用试验
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂菌液，总活菌数在10亿个/毫升以上。
2、试验对虾：投苗至30天的对虾全程使用。设3口实验池和7口对照池。
3、试验场地：漳浦县深土镇某对虾养殖场。
4、试验方法：日常饲养时，取实施例1复合菌剂合池均匀泼洒。每三天使用一次，每亩养殖水体用量为0.5～1L，水质恶化时加倍使用。而对照组不使用菌剂。同时取实施例1复合菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每日拌料投喂实验池对虾，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。而对照组对虾投喂不加菌的饲料。
5、试验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在改善水质、控制水体弧菌数和防治对虾病害等方面，具体为：(1)改善水质，当水质老化时，泼洒复合菌剂，第二天可见水色清爽、嫩、活，使用期间，水色较好，pH值稳定，藻类生长旺盛，未见倒藻等发生；(2)定期使用实施例1复合菌剂，水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，虾苗生长快，期间无发生病害，存活率高，相比对照组存活率提高约30％，说明对对虾虾苗养殖期间有良好作用。
实施例4本发明的微生态制剂在对虾养殖中的应用试验2
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂菌液，总活菌数在10亿个/毫升以上。
2、试验对虾：投苗至养成的对虾全程使用。设3口实验池和7口对照池。
3、试验场地：漳浦县深土镇某对虾养殖场。
4、试验方法：日常饲养时，取实施例1复合菌剂合池均匀泼洒。每五天使用一次，每亩养殖水体用量为1～2L，水质恶化时加倍使用。而对照组不使用菌剂。同时取实施例1复合菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每100kg饲料使用1～2L，每日拌料投喂实验池对虾，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。而对照组对虾投喂不加菌的饲料。
5、试验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在改善水质、控制水体弧菌数和防治对虾病害等方面，具体为：(1)改善水质，当水质老化时，泼洒复合菌剂，第二天可见水色清爽、嫩、活，使用期间，水色较好，pH值稳定，藻类生长旺盛，未见倒藻等发生；(2)定期使用实施例1复合菌剂，水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂；(3)增加摄食量，将复合菌拌饲料投喂对虾，连续投喂3天后可见对虾肠道增粗，肠道中充满食物，活力较高；当对虾呈现病态，出现断肠等肠炎症状时，使用实施例1复合菌剂拌料投喂2天，第三天观察可见肠道恢复正常，摄食情况好转。养殖全程，使用实施例1复合菌剂的3口实验池对虾基本未见病害发生，而7口对照池常有病害发生，使用较多的消毒剂，其中有3口中对照池因病害严重致对虾大规模死亡而最终排塘。对虾最终收成时，实验池比对照池增产约1000～1500kg/亩。
实施例5本发明的微生态制剂在对虾苗养殖中的应用
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂菌液，总活菌数在15亿个/mL以上。
2、试验对虾：凡纳滨对虾虾苗。
3、试验厂地：福建漳州市漳浦县某对虾苗养殖厂。
4、试验方法：选择2口对虾虾苗培育池，其中一只为对照池，一口为实验池，养殖期间，往实验池水体泼洒1ppm的复合益生菌液，每2天使用一次。同时实验池对虾苗拌喂投加复合菌的饲料，取250mL复合菌用原池水稀释后均匀喷洒在20kg饲料上，每两天拌料投喂一次。
5、实验结果：实验池虾苗摄食正常，健康活跃，实验期间未见任何病害发生。实验池水质较好，藻类生长旺盛，水色稳定，无倒藻发生。