一种RNA反义纯化方法与流程

文档序号:12411812阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种RNA反义纯化方法,其特征在于,包含以下步骤:

S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化,得到RNA样品;

S2、探针组溶液的制备:将生物素标记的各探针溶解后混合,于85℃变性3min,快速转移冰浴,得到探针组溶液;

S3、磁珠预处理:使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠;

S4、探针组-磁珠复合物的制备:将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中,得到探针组-磁珠复合物;

S5、反义纯化:向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物,65℃变性10min,37℃、42℃和45℃各洗涤2次,每次洗涤5min,得到RNA-探针组-磁珠复合物;

S6、RNA的洗脱:将RNA-探针组-磁珠复合物加入RNA ElutionBuffer混匀,95℃加热2min,收集上清,向上清中加入Proteinase K Buffer和Proteinase K,温育消化得到洗脱后的RNA;

S7、RNA的纯化:向洗脱后的RNA中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液混匀,离心收集上层水相,向水相中加入5M NaCl溶液、glycogen和无水乙醇,混匀后-80℃沉淀1~16h,离心弃上清,加入预冷的80%乙醇,离心弃上清,室温静置风干,加入无RNase水,65℃温育15min。

2.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S1中取约1×108个细胞,去除培养基后用PBS洗涤一次,进行紫外交联,向交联后细胞中加入15ml预冷的PBS并短暂置于冰上,收集细胞,4℃400g离心3min收集细胞沉淀;向细胞沉淀中加入1.4ml预冷的Lysis Buffer、5μl RNase Inhibitor,充分吹打裂解,抽动混匀3次,冰浴静置裂解10min,向裂解液中加入4.8μl DNase Salt Stock、15μl DNase,37℃温育10min;转移样品到冰浴环境,快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混匀;加入等体积2×Hybridization Buffer,充分混匀后冰上静置10min;4℃16000g离心10min,转移上清至新无RNase离心管中,-80℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S2中每条探针用1×TES配制成100倍nmol的探针溶液,将所有探针溶液混合,取5μl混合液变性处理。

4.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S3磁珠预处理的方法为:用1ml 10mM Tris-HCl pH7.5重悬磁珠,颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清,再重复洗涤2次;用1ml 1×Hybridization Buffer重悬磁珠,颠倒混匀后磁力架上收集磁珠去上清;再向磁珠中加入1ml含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES,室温孵育30min后去除TES溶液。

5.根据权利要求4所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S3中TES中BSA的浓度为0.05~0.5wt%,寡核苷酸随机引物的浓度为10~20μmol/L。

6.根据权利要求4所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S3中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。

7.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S4制备探针-磁珠复合物的方法为:将探针组溶液加入预处理后的磁珠中,并加入100μl 2×TES,25℃温和旋转混合30min,磁力架上收集磁珠去上清;用0.35ml1×TES洗涤磁珠两次,去除TES。

8.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S5中向RNA样品中加入探针组-磁珠复合物,65℃温育变性10min,用含0.5mM PMSF的Wash Buffer 37℃、42℃、45℃各洗涤2次,每次洗涤5min并磁力架上静置1min收集磁珠弃上清;用500μl Wash Buffer悬浮磁珠,35℃摇动洗涤2~4min,磁力架上收集磁珠并去上清,并重复洗涤3~6次,得到RNA-探针组-磁珠复合物。

9.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S6中向RNA-探针组-磁珠复合物中加入50μl RNA Elution Buffer充分混匀后,95℃加热2min,磁力架上收集磁珠并转移上清至新无RNase离心管中,重复上述步骤一次;再向上清中加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg Proteinase K,50℃温育消化1h。

10.根据权利要求1所述的RNA反义纯化方法,其特征在于,步骤S7中RNA的纯化方法为:向洗脱后的RNA样品中加入等洗脱体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液,颠倒混匀15s;13000g 4℃离心10min,收集上层水相,转移到新无RNA酶离心管中;向水相中加入20μl 5M NaCl、2μl Glycogen、600μl无水乙醇,充分颠倒混匀后-80℃沉淀1~16h;4℃16100g离心30min,弃上清;加入1ml预冷的80%乙醇,4℃16100g离心10min,弃上清;室温静置风干10min;加入20~30μl RNase-free water,65℃温育15min。

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