铀酰离子结合七肽的制作方法

本发明属于废水吸附剂及其制备和应用技术领域，涉及一种处理含铀废水的铀酰离子结合七肽和编码该七肽的核酸，含有该核酸的载体、细胞，以及铀酰离子结合七肽的应用。

背景技术：

随着核工业的发展，天然铀的需求量不断增加，在铀矿冶工业的各主要生产环节以及铀元素的应用中，产生了大量的含铀放射性废水。这些含铀废水如不进行排放前处理，将对地表水、地下水和土壤产生放射性污染，从而对环境及人类健康构成极大危害。如何减少废水中铀的放射性危害，同时有效回收利用昂贵而且有限的铀资源，已成为制约铀工业可持续发展的主要问题之一。

生物吸附技术的出现给重金属污染处理带来了新的转机。其中，微生物吸附成本低、效率高、在处理含铀废水和回收铀资源方面有着广阔的应用前景。微生物细胞对废水中重金属离子的吸附一般可分为胞内吸附、细胞表面吸附和胞外吸附。胞内吸附主要是通过重金属离子与细胞内的金属硫蛋白、金属硫蛋白样蛋白、植物螯合素等金属结合蛋白相结合，在细胞内沉淀固定。研究发现，在多种微生物、动物和植物细胞内普遍存在对金属离子具有亲和能力的蛋白质(肽)，称为金属结合蛋白(肽)，它们可与环境中的金属离子通过化学结合作用形成复合物，进而降低、富集或消除金属离子对生物细胞的毒性。金属结合肽的应用范围较广，其中应用领域之一是环境中重金属污染的生物修复。目前研究的金属结合肽主要为天然存在的结合肽，但是，天然结合肽种类有限，且未发现铀酰离子特异性结合肽。

随机肽库技术的出现为研究并筛选铀酰离子特异性结合肽提供了一条有效的途径。随机肽库是由与细胞外壳蛋白融合表达的多肽所组成，库中包含上亿种多肽分子，分别呈现在不同的细胞表面，众多重组细胞即组成了随机肽库。近年来，随机肽库技术已应用于抗原表位筛选、新受体及天然配体结构域的识别和鉴定、药物筛选和设计等研究领域。利用随机肽库技术筛选铀酰离子结合肽，并研究该结合肽对废水中铀酰离子的吸附作用，具有较好的应用前景。

酵母菌被认为是富集金属离子的良好微生物，对铀离子有较强的吸附作用，具有安全、培养简单、生长迅速等优良特性，同时，酵母细胞易于固定化处理，方便机械化和自动化应用。通过细胞表面展示技术将铀酰离子结合肽展示在酵母细胞表面，使结合肽与环境中的铀酰离子直接作用，可以有效提高吸附速率及吸附量。同时，结合肽螯合铀酰离子并将其堆积在细胞表面，不需要破碎菌体细胞就可以将铀酰离子洗脱下来，既方便金属离子的回收利用，也可使细胞循环用于金属除污，降低生产成本。由于吸附作用主要取决于细胞表面结合肽的螯合作用，而不依赖于细胞的生命活动，因此，即使制备的细胞失去了生命活力，只要保证结合肽的正确折叠结构，就不会降低细胞对铀酰离子的吸附量，这无疑将简化细胞吸附剂的使用条件及操作程序。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种处理含铀废水的铀酰离子结合七肽，其对水溶液中的铀酰离子具有高亲和力，同时还提供了铀酰离子结合七肽的编码核酸，含有该核酸的载体、细胞，以及铀酰离子结合七肽的应用。本发明通过筛选铀酰离子结合七肽，并在酵母细胞表面进行展示制备吸附剂，具有潜在的提高细胞吸附量的能力，是一条极具前途的开发新型铀酰离子吸附材料的有效途径。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

铀酰离子结合七肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

编码铀酰离子结合七肽的核酸，其编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一种载体，其为含有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示多核苷酸序列的载体。

一种细胞，其为含有上述载体，或者转化或转染有上述核酸的酿酒酵母细胞，细胞表面展示了铀酰离子结合七肽。

一种铀酰离子特异性结合七肽在制备处理含铀酰离子废水的吸附材料中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明通过筛选噬菌体随机七肽库，得到了两种铀酰离子结合七肽。试验证明，铀酰离子结合七肽对水溶液中的铀酰离子具有高亲和力，能与铀酰离子特异性结合，将铀酰离子结合七肽展示在酵母细胞表面制备吸附材料，可有效提高酵母细胞对废水中铀酰离子的吸附作用，具有较好的应用前景。同时本发明所述的结合肽的筛选方法，也为筛选其它金属离子结合肽提供了切实可行的技术方案。

附图说明

图1为铀酰离子结合七肽对铀酰离子的亲和性测定；

图2为铀酰离子结合七肽对其它金属离子的反筛实验；

图3为本发明实施例2中的重组表达载体pYD-7-4、pYD-7-5示意图；

图4为酿酒酵母细胞EBY100-7-4、EBY100-7-5的免疫荧光检测；

图5为溶液初始液pH对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响；

图6为吸附时间对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响；

图7为铀酰离子初始浓度对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响；

图8为温度对对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

本实施例中提供了一种铀酰离子结合七肽的筛选方法，包括以下步骤：

(1)铀酰离子螯合树脂的制备

在无菌条件下，移取100μl树脂于1.5mL离心管中，13000rpm，5min离心，去上清。用1mL无菌水重悬树脂，13000rpm，5min离心，重复4次。将处理过的树脂加入150mL，浓度为20μg/mL的无菌铀标溶液中，150rpm振荡过夜。13000rpm，10min离心，去上清，获得了铀酰离子螯合树脂(M^U+)。实验中设置灭菌超纯水处理的树脂作为对照(M^-)。

(2)随机七肽库的第一轮筛选

取100μl M^U+、M^-树脂各一支，各加入1000μl 0.1％TBST(pH7.4)，清洗2遍。在M^U+、M^-树脂中分别加入10μl噬菌体七肽库(购于美国New England Biolabs，NEB公司)。25℃，100rpm室温温和混匀1h，4℃2000rpm离心30s。分别加入1000μl 0.1％TBST，100rpm震荡1min后，4℃2000rpm离心30s，弃上清，清洗2次。加入500μl 20mmolID，4℃2000rpm离心30s，弃上清，清洗2次。加入1000μl 0.1％TBST，4℃2000rpm离心30s，清洗5次。加入300μl 200mmol ID，100rpm，25℃摇床20min；4℃2000rpm离心30s，取上清，重复2次。合并2次的上清液，即为第一轮筛选后的噬菌体洗脱物。根据常规M13方法，测定少量(1μl)洗脱物的滴度。

(3)噬菌体洗脱液的扩增

将10μl洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(该菌体应处于对数前期)，37℃剧烈摇动(150rpm)培养4.5h。转移培养物至一新离心管中，4℃10000rpm离心10min，然后将上清液转移到另一离心管中，再离心。转移80％上清到一新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀至少60min。4℃，12000rpm离心15min，去上清液。4℃，12000rpm离心30s，去除残留上清液。加入1mL TBS重悬沉淀物，转移悬液到微量离心管中，4℃14000rpm离心5min，沉淀残余细胞。转移上清到另一新鲜微量离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl沉淀上清液，冰上孵育30min。沉淀物重悬于200μl TBS，4℃10000rpm离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮噬菌体洗脱物的扩增物。

(4)第二轮筛选

将扩增后的噬菌体液用TBS稀释为1×10¹²cfu/mL，取100μl分别加入到M^U+、M^-树脂中。第二轮筛中选用1000μl 0.3％TBST，清洗4次，弃上清。加入500μl 20mmolID清洗4次，弃上清。加入1000μl 0.3％TBST清洗8次，弃上清。加入300μl 200mmolID，100rpm，25℃摇床20min。2000rpm，4℃离心30s，取上清，重复2次，合并2次的上清液，即为第二轮筛选后的噬菌体洗脱物。测洗脱物的滴度。

在筛选过程中，计算每轮M^U+树脂的洗脱物滴度与M^-树脂的洗脱物滴度的比值(P/N值)，来反映特异性结合噬菌体的富集程度。结果显示(如表1)，经过两轮筛选，噬菌体富集度逐渐升高，表明得到了与铀酰离子特异结合的噬菌体克隆。

表1 两轮亲和筛选对噬菌体的富集

(5)单克隆噬菌体的扩增

将ER2738过夜培养物按1：100的比例稀释至20ml LB液体培养基中。用灭菌吸头随机挑取20个蓝色噬菌斑，分别加入到ER2738培养液中，37℃摇床培养4.5-5h。将培养物于4℃12000rpm离心30s。取上清转入新管中，离心。取80％的上清转入新离心管中，此即为扩增的单克隆噬菌体。

(6)噬菌体展示短肽对铀酰离子的亲和性测定

为了检测筛选到的噬菌体与铀酰离子的亲和性，随机挑选20个噬菌体单克隆并进行扩增，分别将噬菌体扩增液与M^U+、M^-两种树脂混合，通过洗脱反应，测得各处理洗脱液的噬菌体滴度，计算M^U+树脂的洗脱物滴度与M^-树脂的洗脱物滴度比值(P/N值)。结果发现，20个噬菌体展示的七肽对铀酰离子均具有一定的亲和力，但是，不同的结合肽亲和力不同，其中7-1、7-4、7-5、7-8、7-10、7-12、7-16这7条结合肽对铀酰离子的亲和性较高，结果如图1。

(7)反筛实验

制备铈、铯、锶、钆、钐5种混合金属离子的螯合树脂(M^H+)及铀酰离子螯合树脂(M^U+)，设置灭菌超纯水处理的树脂作为对照(M^-)。取100μl M^H+、M^U+、M^-树脂各一支，分别加入1000μl0.1％TBST(pH7.4)清洗2次。扩增含有上述7条结合肽的噬菌体克隆，将M^H+、M^U+、M^-三种树脂分别与噬菌体扩增液混合，25℃，130rpm摇床室温1h。加入1000μl 0.1％TBST，2000rpm，4℃离心15s，弃上清，清洗10次。加入500μl 20mmol ID，2000rpm，4℃离心15s，弃上清，清洗8次。加入0.1％的TBST，2000rpm，4℃离心15s，弃上清，清洗10次。加入300μl 200mmol的ID，200rpm，25℃洗脱20min，2000rpm，4℃离心20s，取上清，重复2次。合并2次的洗脱液，测滴度，计算P/N值，结果如图2。

结果表明，7-4、7-5噬菌体对铀酰离子的亲和力远高于对混合金属离子的亲和力。说明，噬菌体7-4、7-5中插入的七肽为铀酰离子特异性结合肽。

(8)噬菌体DNA序列测定

挑取7-4和7-5的噬菌体克隆，用-28gIII(如SEQ ID NO：5所示)和-96gIII测序引物(如SEQ ID NO：6所示)交由苏州金唯智生物科技有限公司测序。得到的两条铀酰离子结合七肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。推测其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

实施例2

本实施例中提供了一种铀酰离子结合七肽在酿酒酵母细胞表面的展示方法，包括以下步骤：

(1)表面展示载体的构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成两条铀酰离子结合七肽的编码DNA序列，并连接到表面展示载体pYD1上，形成表达载体pYD-7-4和pYD-7-5(如图3所示)。

(2)酿酒酵母细胞的转化

活化酿酒酵母EBY100菌株，挑取5个单菌落至50mL YPD液体培养基中，30℃，170rpm过夜培养至OD600至1.0。将过夜培养的菌液稀释于新的50mL YPD液体培养基中，使OD600为0.6，30℃，170rpm培养3h，测OD600达1.0。用50mL离心管收集菌体，2500rpm离心5min，弃上清，用40mL 1×TE重悬菌体。2500rpm继续离心5min，弃上清，菌体用2mL 1×LiAc/0.5×TE重悬。30℃，80rpm温育1h；分装，每管100μl。在管中加入表达载体(pYD-7-4、pYD-7-5、pYD1)、SS-DNA及700μl 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均匀；30℃温育30min，后加入88μl DMSO，混合均匀。42℃热激7min；4000rpm离心1min，除去上清，收集菌体。用1mL 1×TE重悬菌体，4000rpm继续离心1min，去上清，菌体用100μl 1×TE重悬。涂布于MD选择性平板，30℃倒置培养。培养36h后，在MD选择性平板上，有酵母菌落出现。

(3)酿酒酵母转化子的诱导表达及免疫荧光检测

挑单菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，30℃震荡培养过夜，至OD600于2～5之间，3000～5000rpm，室温离心5～10min。双蒸水洗涤沉淀，离心5min，重复2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞，至OD600为0.5～1。20℃，180rpm震荡培养24h，即为表达了结合七肽的酵母细胞。

取诱导后的细胞培养液，3000～5000rpm，4℃离心5～10min。1×PBS洗涤细胞，3000～5000rpm，4℃离心5～10min，重复三次。用250μl的1×PBS，1mg/ml BSA重悬细胞，加入1μg抗6×His标签的免疫球蛋白(IgG)。冰浴30min，不时混匀，3000～5000rpm，4℃离心5～10min。1×PBS清洗细胞2次。250μl 1×PBS，1mg/ml BSA重悬细胞，加入1μg的抗鼠IgG-FITC。黑暗条件下冰浴30min，不时颠倒离心管。1ml 1×PBS清洗细胞2次。40μl 1×PBS重悬细胞，荧光显微观察(如图4)。结果表明结合肽7-4、7-5在酵母细胞表面成功表达。将成功表达结合肽7-4、7-5的酵母工程菌分别命名为EBY100-7-4、EBY100-7-5，将表达了载体pYD1的酵母细胞命名为EBY100-pYD。

实施例3

本实施例中提供了一种铀酰离子结合七肽在制备处理含铀废水的吸附材料中的应用，包括以下步骤：分别挑取酵母工程菌EBY100-7-4、EBY100-7-5单菌落至10ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，30℃震荡培养过夜，至OD600于2～5之间，3000～5000rpm，室温离心5～10min。双蒸水洗涤沉淀，离心5min，重复2次。用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞，至OD600为0.5～1。20℃，180rpm震荡培养24h，收集细胞，双蒸水洗涤，冷冻干燥后，即可用于含铀废水的处理。试验设酵母细胞EBY100-pYD、EBY100处理为对照。

试验例

(1)pH值对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响

准确量取50mL，25μg/ml的铀标溶液于150ml的锥形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH调节pH值，使pH值分别为3.50、4.32、4.73、5.34、5.78、6.13、6.58、6.89、7.23。分别加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒温振荡器上吸附12h。13000rpm室温离心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法测定溶液中铀酰离子的浓度。试验设置酵母细胞EBY100-pYD和EBY100处理为对照。

铀酰离子的吸附量按照以下公式计算(下同)：

式中：q_e－吸附量，mg/g；V－溶液的体积，L；C_e－铀酰离子溶液平衡浓度，mg/L；C₀－铀酰离子溶液初始浓度，mg/L；m－吸附剂质量，g。

结果显示(如图5)，溶液的初始pH值对吸附剂吸附铀(VI)的性能影响显著，当pH为4.73时，四种吸附剂对铀酰离子的吸附量最大。其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5对铀酰离子的吸附量分别为80.83mg/g、79.47mg/g，显著高于酵母细胞EBY100和EBY100-pYD。结果表明，铀酰离子结合肽7-4、7-5在酵母细胞表面的展示显著提高了细胞对铀酰离子的吸附量。

(2)吸附时间对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响

准确量取50mL，25μg/ml的铀标溶液于150ml的锥形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH调节pH值为4.73。分别加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒温振荡器上分别吸附0h、0.25h、0.75h、1h、2h、3h、4h、5h和6h。13000rpm室温离心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法测定溶液中铀酰离子的浓度。试验设置酵母细胞EBY100-pYD和EBY100处理为对照。

结果显示(如图6)，随着吸附时间的延长，四种细胞对铀酰离子的吸附量逐渐增加，在3h时吸附基本达到平衡。其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5对铀酰离子的吸附量分别为80.30mg/g、80.35mg/g，比酵母细胞EBY100分别提高了26.71％和26.79％。

(3)初始浓度对酵母工程菌吸附铀离子的影响

铀酰离子的初始浓度是影响吸附的重要因素。设置铀酰离子初始浓度分别为10、20、30、40、50、60、80、100mg/L。加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在28℃，145rpm的恒温振荡器上吸附3h。13000rpm室温离心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法测定溶液中铀酰离子的浓度。试验设置酵母细胞EBY100-pYD和EBY100处理为对照。

结果显示(如图7)，随着铀酰离子初始浓度的增加，四种细胞对铀酰离子的吸附量不断增加，其中酵母工程菌EBY100-7-4和EBY100-7-5对铀酰离子的吸附量显著高于酵母细胞EBY100-pYD和EBY100。表明铀酰离子结合肽7-4、7-5增强了酵母细胞对铀酰离子的吸附作用。

(4)吸附温度对酵母工程菌吸附铀酰离子的影响

准确量取50mL，50μg/ml的铀标溶液于150ml的锥形瓶中，用0.1mol/L的HCl、NaOH调节pH值为4.73。分别加入0.03g酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4，在不同温度(288.15K、293.15K、298.15K、303.15K、308.15K、313.15K)下，145rpm的恒温振荡器上吸附3h。13000rpm室温离心5min，取上清，用偶氮胂Ⅲ光度法测定溶液中铀酰离子的浓度。试验设置酵母细胞EBY100-pYD和EBY100处理为对照。

结果显示(如图8)，试验设置的6种温度下，酵母工程菌EBY100-7-1、EBY100-7-4对铀酰离子的吸附量均显著高于酵母细胞EBY100和EBY100-pYD。表明铀酰离子结合肽7-4、7-5增强了酵母细胞对铀酰离子的吸附作用。

<110> 东华理工大学

<120> 铀酰离子结合七肽

<160> 6

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽1

<222> (1)...(7)

<223>

<400> 1

Leu His Leu Pro Arg Met Thr

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<220>

<221> 短肽2

<222> (1)...(7)

<223>

<400> 2

Leu Ser Gln Arg Met Gln Arg

1 5

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(21)

<223>

<400> 3

CTGCATCTTC CACGTATGAC T 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<222> (1)...(21)

<223>

<400> 4

CTCAGTCAGC GTATGCAGCG A 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -28 gIII测序上游引物

<222> (1)...(22)

<223>

<400> 5

GTATGGGATT TTGCTAAACA AC 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<220>

<221> -96 gIII测序下游引物

<222> (1)...(20)

<223>

<400> 6

CCCTCATAGT TAGCGTAACG 20