1.一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品,其特征在于:
(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物,其中,
上游引物序列为:5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQ NO.1),
下游引物序列为:5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQ NO.2);
(2)所述的TaqMan荧光探针序列为:
5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’(SEQ NO.3);
(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒:
TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。
2.根据权利要求1所述的一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于,所述的阳性标准品由以下方法制得:
1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列,利用Clustal_X软件进行序列同源性分析,然后以blastn网络工具比对分析其特异性,寻找所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列,再按常规方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段;
2)将步骤(1)合成的DNA片段插入质粒载体pUC57(Amp+)中构建成重组质粒;
3)取5μl步骤(1)所得到的重组质粒与100μl DH5α感受态细胞混合后,冰浴20分钟;42℃水浴槽中热冲击70~90秒后,迅速冰浴5分钟;加入500μl LB肉汤培养基,混匀,37℃200rpm摇床培养1小时,得菌液;取100μl菌液在含浓度为100μg/μl的氨苄西林、浓度为20μg/μl的X-gal和浓度为200μg/μl的IPTG的LB培养基平板上进行涂布,培养18小时;然后通过蓝白斑筛选,挑取培养基上的白色菌株进行扩大培养;
4)取扩大培养后的白色菌株,按Omega公司提供的质粒快速提取试剂盒的要求进行提取,然后用去离子水稀释至106copies/μl,即得阳性标准品。