一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。

背景技术：

埃博拉病毒是一种能引起的人畜共患烈性传染病的丝状病毒科病毒，能引起埃博拉出血热，具有高致病性，病死率高的特点，被世界卫生组织列为对人类危害最严重的病毒之一，生物安全等级4级(BSL-4)。

目前，我国扎伊尔型埃博拉病毒常规检测方法有血清学反应、核酸杂交、抗原抗体ELISA等技术，但这些试验或方法，存在操作繁琐，所需时间长(约2天以上)。现有扎伊尔型埃博拉病毒检测技术依然很少，且大多并不可靠，灵敏度低、特异性差。过去推广使用的核酸检测方法于2014年西非疫情中被证实存在严重的假阴性情况，表明扎伊尔型埃博拉病毒检测引物、探针亟需更新。本专利旨在建立一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，对过去的方法进行更新推广。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高的优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括引物、TaqMan荧光探针和阳性标准品，其特征在于：

(1)所述的引物为扩增扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因的高度保守片段的一对引物，其中，

上游引物序列为：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’(SEQ NO.1)，

下游引物序列为：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’(SEQ NO.2)；

(2)所述的TaqMan荧光探针序列为：

5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’(SEQ NO.3)；

(3)所述的阳性标准品为含有以下序列DNA片段的重组质粒：

TGGGACCGGACTGCTGTATCGAACCACATGATTGGACCAAGAACATAACAGACAAAATTGATCAGATTATTCATGATTTTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGGGGGACAATGACAATTGGTGGACAGGATGGAGACAATGGATACCGGCAGGTATTGGAGTTACAGG(SEQ NO.4)。

上述方案中，所述的阳性标准品由以下方法制得：

1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列，利用Clustal_X软件进行序列同源性分析，然后以blastn网络工具比对分析其特异性，寻找所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列，再按常规方法合成出所述氨基酸序列的DNA片段；

2)将步骤(1)合成的DNA片段插入质粒载体pUC57(Amp⁺)中构建成重组质粒；

3)取5μl步骤(1)所得到的重组质粒与100μl DH5α感受态细胞混合后，冰浴20分钟；42℃水浴槽中热冲击70～90秒后，迅速冰浴5分钟；加入500μl LB肉汤培养基，混匀，37℃200rpm摇床培养1小时，得菌液；取100μl菌液在含浓度为100μg/μl的氨苄西林、浓度为20μg/μl的X-gal和浓度为200μg/μl的IPTG的LB培养基平板上进行涂布，培养18小时；然后通过蓝白斑筛选，挑取培养基上的白色菌株进行扩大培养；

4)取扩大培养后的白色菌株按Omega公司提供的质粒快速提取试剂盒的要求进行提取，然后用去离子水稀释至10⁶copies/μl即得阳性标准品。

本发明所述的试剂盒的使用方法如下：

(1)反应体系如表1所示：

表1本发明试剂盒PCR反应体系

(3)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成10⁹～10³copies/μl 7个浓度梯度，按照步骤(1)和(2)所述的反应体系和反应程序进行扩增；

(4)样品检测：将阳性标准品、阴性对照和待检样品RNA按照上述反应体系进行配制和反应程序进行扩增后，从仪器配套软件中得到各个样品对应Ct值；

(5)结果判断：Ct值≤35.0为阳性，无数值或大于35.0为阴性。

本发明试剂盒与常用的血清学方法类的试剂盒相比具有更高的特异性；与过去的埃博拉病毒荧光定量PCR检测试剂盒相比能更快速准确地检测出扎伊尔型埃博拉病毒，检测时间45min，最低检测下限达到10copies/μl，具有良好的特异性，可用于临床诊断，传染病疫情预防监控，出入境检验检疫及其相关领域的扎伊尔型埃博拉病毒的定性和定量快速实时核酸检测。

附图说明

图1为所述编码基因中高度保守区域的氨基酸序列SEQ NO.4在扎伊尔型埃博拉病毒基因组中的位置图。

图2为采用本发明所述试剂盒进行PCR扩增后所绘制的标准曲线。

图3为实施例2中本发明试剂盒敏感性测定结果的曲线图，图中自左向右依次为起始模板浓度分别是10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μl的扩增曲线，最下面靠近横坐标的曲线(Ct值很小的)为阴性对照。

图4为实施例2中本发明试剂盒特异性测定结果的曲线图，图中自左向右对应起始模板分别是阳性标准品、含重组质粒的DH5ɑ工程菌的扩增曲线，无Ct值曲线的模板是I型登革病毒RNA、寨卡病毒RNA、阴性对照的扩增曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例来说明本发明具有的有益效果。

实施例1：(制备试剂盒)

1、检测扎伊尔型埃博拉病毒荧光定量PCR试剂盒的组成：

上游引物：5’-GAACCACATGATTGGACCAAGA-3’，10μM；

下游引物：5’-TAACTCCAATACCTGCCGGTATC-3’，10μM；

荧光探针：5’FAM-TTGTTGATAAAACCCTTCCGGACCAGG-BHQ 3’，10μM；

阳性标准品：含有DNA片段SEQ NO.4的pUC57(Amp⁺)重组质粒，浓度是10⁶copies/μl。

聚合酶混合液：含5U/μl Taq DNA聚合酶和200U/μl逆转录酶，购自北京康润诚业生物科技有限公司；

PCR反应缓冲液(5×)：购自北京康润诚业生物科技有限公司；

上述核酸均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、所述定量阳性模板的制备方法是：

(1)根据网络数据库GenBank上公布的扎伊尔型埃博拉病毒包膜糖蛋白的编码基因序列，利用Clustal_X软件进行序列同源性分析，然后以blastn网络工具比对分析其特异性，寻找编码基因中具有高度保守的区域，然后提交序列信息由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ NO.4的DNA片段；

(2)将该片段插入质粒载体pUC57(Amp⁺)中构建成重组质粒，具体方法是：

a.DNA片段SEQ NO.4与质粒载体pUC57(Amp⁺)的连接和转化：

1)在微量离心管中加入：

pUC57(Amp⁺) 1μl

DNA片段(SEQ NO.4) 4μl

dH₂O 4μl；

2)加入1μl的T4DNA Ligase；

3)16℃反应过夜，连接；

4)取感受态细胞DH5α100μl于离心管，置于冰中预冷20min；

5)加入连接产物5μl；

6)轻轻混匀后冰中预冷30min；

7)42℃70～90S热冲击处理；

8)迅速移至冰中冷却5min；

9)加入37℃LB液体培养基500μl；

10)37℃、200r/min振荡培养1h；

11)取100μl培养基涂布于含100μg/μl氨苄西林、20μg/μlX-gal、200μg/μl IPTG的LB培养基平板；

12)37℃培养18h；

13)取5个菌落放入含100μg/μl氨苄西林LB体培养基4ml中摇菌扩增18h。

b.重组质粒提取：

1)取扩增菌液50ml离心5000g 10min；

2)弃上清，加入250μl SolutionⅠ/R NaseA悬浮细胞；

3)加入250μl SolutionⅡ，轻轻混均，上下颠倒4～6次；

4)加入350μl SolutionⅢ，轻轻混均，上下颠倒直到白色絮状物形成；

5)离心13,000g 10min；

6)小心把清澈的上清加入到干净的HiBind^TM DNA Miricolumn中，离心Miricolumn10,000g 1min；

7)去液，加500μl bufferHB洗管后，离心10,000g 1min；

8)弃液，加入700μl DNA wash buffer，离心10,000g 1min；

9)重复步骤8)；

10)再离心空管13,000g 3min；

11)把空管放入干净的1.5ml离心管中，加入去离子水60μl，离心13,000g 2min。

3、鉴定：将所得重组质粒用设计的引物F、R进行普通PCR，2.0％的琼脂糖凝胶电泳，得到条带大小为145bp。将样品测定浓度后稀释成10⁶copies/μl。

上述SEQ NO.4所示序列的长度为位于169bp，位于扎伊尔型埃博拉病毒基因组序列的1949～2117bp之间(参见图1)。

下述实施例所用的试剂盒均为实施例1所述的试剂盒。

实施例2：(体外检测实验)

1、模板的制备：

a.试剂：RNA提取试剂盒，购自Axygen公司。

b.标准菌株培养及制备：

阳性标准品：10⁶copies/μl重组质粒；

待检测样品：以含重组质粒的DH5ɑ工程菌为阳性样品，以I型登革病毒、寨卡病毒的动物细胞培养基和无重组质粒DH5ɑ菌株作为模拟样品，菌无需提取RNA以全基因组作模板；

阴性对照：去离子水。

c.RNA的提取：取含I型登革病毒、寨卡病毒的动物细胞培养基200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，终体积为30μl(详细步骤请参照试剂盒说明书)。提取的RNA模板－80℃保存备用。

2、荧光定量PCR反应：

1)反应体系如表2所示：

表2本实施例试剂盒PCR反应体系

2)方法：每批反应设一个阳性对照，一个阴性对照(由去离子水取代)，反应程序为：

仪器：Roche实时荧光定量PCR仪LightCycler 96，Roche公司(瑞士)。

3)定量标准曲线制备：

将重组质粒模板按10倍倍比稀释成10⁹～10³copies/μl共7个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序进行扩增，反应结束后计算机自动绘制标准曲线，如图2所示。起始模板在10⁹～10³copies/μl时线性良好，软件分析得到标准曲线：Y＝-3.7514X+43.31，R²＝0.999。

4)敏感性测定：

取阳性标准品按10倍倍比稀释为10⁶～10¹copies/μl共6个浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序进行扩增，用荧光定量PCR分析，以确定最低检测下限，如图3所示。起始模板在10¹copies/μl时Ct值为34.44，说明该检测方法的最低检测下限为10¹copies/μl。

5)特异度测定

取阳性标准品作阳性对照，以含重组质粒的DH5ɑ工程菌为阳性样品，以I型登革病毒、寨卡病毒的RNA和无重组质粒DH5ɑ菌株作为模拟样品，去离子水为阴性对照，按照上述反应体系和反应程序进行扩增，检验反应的特异性，结果如图4所示。阳性对照和阳性样品的荧光定量PCR结果呈现规律的扩增曲线，Ct均小于35，呈阳性；I型登革病毒、寨卡病毒的RNA和无重组质粒DH5ɑ菌株作为模拟样品的检测结果均无Ct值，呈阴性。与预期结果完全符合，无非特异度扩增。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种检测扎伊尔型埃博拉病毒的荧光定量PCR试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaccacatg attggaccaa ga 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taactccaat acctgccggt atc 23

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgttgataa aacccttccg gaccagg 27

<210> 4

<211> 169

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgggaccgga ctgctgtatc gaaccacatg attggaccaa gaacataaca gacaaaattg 60

atcagattat tcatgatttt gttgataaaa cccttccgga ccagggggac aatgacaatt 120

ggtggacagg atggagacaa tggataccgg caggtattgg agttacagg 169