一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr‑1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

多粘菌素属于阳离子多肽抗生素家族，有A、B、C、D、E五种，抗菌谱相互类似而范围宽广，通常被认为是对抗耐多药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线，临床上常用的是多粘菌素B（polymyxin B）和多粘菌素E（colistin，黏菌素）。

近年来，发现了一个新的基因mcr-1，可使细菌对多粘菌素产生高度耐药性，其广泛存在于取自中国南方的猪和患者的肠杆菌科细菌中，包括具有流行可能性的菌株。已知，mcr-1基因产物属于磷酸乙醇胺转移酶家族，能够催化磷脂酰乙醇胺转移到脂质A的第四个磷酸基团上，使得脂质A的结构发生改变，从而降低了多粘菌素E与脂多糖的亲和力，介导多粘菌素耐药。mcr-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以水平基因转移的方式在不同菌株中进行遗传物质的交换，这意味着mcr-1基因介导的耐药性可以在细菌中相互传播。

各项研究表明，截止至2016年底，mcr-1基因已经在不少于16个国家中被发现，包括东南亚、柬埔寨和马来西亚的7个国家，9个欧洲国家。特别注意的是，质粒传播的mcr-1基因至少存在于3个肠道菌种中（大肠杆菌、沙门氏菌和克雷伯氏肺炎菌），宿主包括至少三种家禽和家畜（鸡、猪和牛），从而引发了公众对于其全球传播和扩散的担忧。因此，mcr-1基因的检测对于监控耐药细菌的爆发，指导患者感染用药具有重要作用。

对于mcr-1基因的检测，传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用，因而研发一种简便、快速的细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的检测方法具有极大的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组；

本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒；

本发明的另一个目的在于提供一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

内引物1：5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’；

内引物2：5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’；

外引物1：5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’；

外引物2：5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’；

环引物1：5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’；

环引物2：5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’。

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所示的LAMP引物组。

作为上述试剂盒的优选，LAMP引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为：(6～8)：(1～2)：(3～4)。

作为上述试剂盒的改进，还含有DNA聚合酶、LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。

作为上述试剂盒配方的优选，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

作为上述试剂盒配方的优选，LAMP反应液含有：10 mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSO₄水溶液、5 mM 甜菜碱，四者的体积比为(6～8)：（4～5）：（2～3）：（8～10）。

作为上述试剂盒配方的优选，显色剂为SYBR GREENⅠ。

作为上述试剂盒配方的优选，阳性对照为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的质粒，阴性对照为DEPC水。

一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法，包括如下步骤：

（1）提取待检样品DNA；

（2）利用LAMP引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应；

（3）结果判断：反应结束后，在反应管中加入1～2µL显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现绿色，判定为阳性，若呈现橙色，判定为阴性；

上述方法所用的引物与试剂如权利要求1～8任一项所述；

上述方法用于非疾病的诊断与治疗。

作为上述方法的优选，等温基因扩增反应的25μL反应体系含有：内引物各8 pmol/µL，外引物各1 pmol/µL，环引物各4 pmol/µL，反应液 12.5µL，DNA聚合酶8U，待检DNA 1～100 ng，用灭菌去离子水补齐到25µL；等温基因扩增反应的条件为：60～65℃反应55～65min。

本发明的有益效果是：

本发明针对细菌多粘菌素耐药基因mcr-1特异性设计了6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确识别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1。

本发明的试剂盒方便快捷，加入显色剂后即可观察结果，能在较短的时间内鉴别细菌多粘菌素耐药基因mcr-1，不需要昂贵的仪器设备，灵敏度高，特异性好，适合现场检测。

附图说明

图1：本发明对阴性样品和阳性样品的显色检测结果，图中，1：不含mcr-1基因的细菌粗提DNA（阴性样品）；2：细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因mcr-1样本（阳性样品）；

图2：采用实施例2方法的检测灵敏度结果，图中，1为DEPC水，2～11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒，浓度依次为1.0×10^-0、1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹拷贝/μL；

图3：采用常规PCR方法的检测灵敏度结果，图中，1为DEPC水，2～11为含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的pMD19-T质粒，浓度依次为1.0×10^-0、1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹拷贝/μL，M为DNA Marker，条带至上而下为1200bp、900bp、700bp、500bp、300bp、100bp；

图4：实施例4的特异性验证结果，图中，1：DEPC水，2：CTX-M-1，3：PME-1，4：SME-1，5：CMY-2，6：KPC-1，7：IMP-9，8：VIM-2，9：TEM，10：CTX-M-9，11：mcr-1。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1、快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒的建立

快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的试剂盒，包括以下成分：（1）LAMP检测引物组；（2）DNA聚合酶；（3）LAMP反应液；（4）显色剂；（5）阳性对照和阴性对照。

（1）LAMP检测引物组

根据细菌多粘菌素耐药基因mcr-1（GenBank登录号为：KX886345.1），针对其6个区域，进行LAMP引物设计，经过大量的引物特异性实验，优选出特异性好的的LAMP检测引物组，包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

内引物1：5’- GCGATGGGATAGGTTTGGCTGTGTTGCCGTTTTCTTGAC-3’（SEQ ID NO：1）；

内引物2：5’- TGCTGACGATCGCTGTCGGCACATAGCGATACGATGAT -3’（SEQ ID NO：2）；

外引物1：5’- TGATGCAGCATACTTCTGTG -3’（SEQ ID NO：3）；

外引物2：5’- GACCGTGCCATAAGTGTC -3’（SEQ ID NO：4）；

环引物1：5’- AAGGTAAGATTGGCGGTCG -3’（SEQ ID NO：5）；

环引物2：5’- CTACTGATCACCACGCTGTT -3’（SEQ ID NO：6）。

（2）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶。

（3）LAMP反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄、5mM 甜菜碱，四者的体积比为8：5：3：10。

（4）显示剂：SYBR GREEN Ⅰ。

（5）阳性对照：含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的pMD19-T质粒；利用常规的质粒构建方法将基因mcr-1片段插入pMD19-T质粒中得到。

（6）阴性对照：DEPC水。

实施例2、快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的方法

利用实施例1的试剂盒快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1，具体步骤如下：

（1）提取待检样品DNA：

采用水煮法提取细菌基因组DNA。

（2）利用LAMP检测引物组对待检样品DNA进行等温基因扩增反应：

等温基因扩增反应的25μL体系为：内引物1、2终浓度各为8 pmol/µL，外引物1、2终浓度各为1 pmol/µL，环引物1、2终浓度各为4 pmol/µL，反应液 12.5µL，DNA聚合酶8U，待检样品DNA 50 ng，用灭菌去离子水补齐到25µL，然后加入20µL的密封液；

等温基因扩增程序为：63℃反应60min。

（3）结果判断：

反应结束后，在反应管中加入1～2µL显色剂，混匀后即可观察反应液的颜色：若呈现绿色，判定为阳性，若呈现橙色，判定为阴性。

上述检测方法对阳性样品和阴性样品的检测结果如图1所示，1号为不含mcr-1基因的细菌粗提DNA，即阴性样品，呈现橙色，2号为细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因mcr-1样本，即阳性样品，呈现绿色。

实施例3、灵敏度实验

取阳性对照品（即构建好的含有细菌多粘菌素耐药基因mcr-1片段的pMD19-T质粒），测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10⁹拷贝/μL的浓度作为样品进行实验；分别用实施例2的检测方法和常规PCR方法进行检测。

常规PCR检测方法所用的引物序列如下所示：

MCR-1-F：CGGTCAGTCCGTTTGTTC （SEQ ID NO：7）；

MCR-1-R：CTTGGTCGGTCTGTAGGG （SEQ ID NO：8）。

采用实施例2检测方法的检测结果如图2所示：其对mcr-1基因的最低检出限为：1.0×10⁴拷贝/μL。

采用常规PCR方法的检测结果如图3所示：其对mcr-1基因的最低检出限为：最低检出限为：1.0×10⁶拷贝/μL。

实施例4 特异性实验

利用实施例2的方法分别对经鉴定不含mcr-1基因但含其他耐药基因的9株临床分离株DNA进行检测，所述的其他耐药基因分别为CTX-M-1、PME-1、SME-1、CMY-2、KPC-1、IMP-9、VIM-2、TEM、CTX-M-9，以DEPC水为阴性对照，以含mcr-1基因的临床分离株DNA为阳性对照。

检测结果如图4所示：仅细菌多粘菌素耐药基因mcr-1管为绿色，其余管为橙色；说明表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将mcr-1及非mcr-1区分开来。

以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，且不需要昂贵的仪器设备，肉眼显色观察即可，适合现场检测。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种快速检测细菌多粘菌素耐药基因mcr-1的LAMP引物组、试剂盒及检测方

法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttggtcggt ctgtaggg 18