一种乳腺癌复发风险评估21基因检测引物及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种专用于乳腺癌复发风险评估21基因的核酸序列的检测试剂盒。

背景技术：

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全球每年约有120万名妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌。在我国乳腺癌的平均死亡率为2.61/10万，以沿海几个城市的死亡率显著偏高，城市的死亡率比农村高出1.4倍。我国近几年来其发病率呈逐年上升趋势，尽管临床研究已经取得了较大的进步，但是其复发及转移率仍然很高。近20年来，以手术为中心，化疗、放疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗模式得到长足的发展，使乳腺癌的复发和死亡率显著降低，但仍然缺乏有效的方法能够较为准确地预测患者的复发风险并给予相应的治疗。

21基因复发风险评估是一种根据21个基因联合检测，通过一定公式计算复发分数来判断乳腺癌复发风险的方法。其由16个癌症相关基因和5个参考基因组成。癌症相关基因大体分为5类，分别为增殖相关基因(ki67、stk15、survivin、ccnb1和mybl2)、表皮生长因子受体相关基因(grb7和her2)、激素相关基因(er、pgr、bcl2和scube2)、浸润相关基因(mmp11和ctsl2)和3个未分类基因(gstm1、cd68和bag1)。5个参考基因分别为actb、gapdh、rplpo、gus和tfrc。上述基因的选择是根据癌症相关文献、微阵列数据资料、基因组学数据库和分子生物学资料选定250个基因作为候选基因。根据3个独立的临床试验共447例患者的研究结果，选取与远处复发显著相关的基因，对250个候选基因进一步筛选，最终确定了上述16个癌症相关基因，并确定了5个管家基因作为参考基因。该项检测适用于淋巴结阴性、雌激素受体阳性且将来可能接受三苯氧胺治疗的临床i、ⅱ期乳腺癌患者。通过分析21个基因的表达来确定rs分值(0～100分)，rs<18、18≤rs≤30、rs≥31分别为低、中、高危患者。2008年，《美国国立综合癌症网络(nccn)乳腺癌临床实践指南》指出，对于er阳性、her2阴性、腋窝淋巴结阴性、肿瘤大小为0.6～1.0cm的中低分化或伴不良预后因素者，或肿瘤>1cm者，考虑应用rs对患者行进一步分析，对高危者予以术后辅助化疗(2b类)。

实时荧光定量pcr技术(real-timequantitativepolymerasechainreaction简称realtimepcr)是在定性pcr技术基础上发展起来的核酸定量技术，在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过ct值和标准曲线对样品中的dna(或cdna)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对dna/rna模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量pcr技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

本发明利用荧光定量的优点，具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，采用荧光定量聚合酶链式反应同时对乳腺癌复发风险评估的21基因进行扩增检测，从而考虑是否需要辅助化疗等临床治疗措施。

技术实现要素：

本发明的目的是开发一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现乳腺癌复发风险评估的21基因快速检测，以弥补现有检测方法的不足。

一种乳腺癌复发风险评估21基因检测引物，包括seqidno.：1～42所示的核苷酸序列。

具体的引物扩增信息如下：

(1)扩增癌症相关基因ki67基因的特异性引物，如seqidno：1和seqidno：2所示；

(2)扩增癌症相关基因stk15基因的特异性引物，如seqidno：3和seqidno：4所示；

(3)扩增癌症相关基因survivin基因的特异性引物，如seqidno：5和seqidno：6所示；

(4)扩增癌症相关基因ccnb1基因的特异性引物，如seqidno：7和seqidno：8所示；

(5)扩增癌症相关基因mybl2基因的特异性引物，如seqidno：9和seqidno：10所示；

(6)扩增癌症相关基因grb7基因的特异性引物，如seqidno：11和seqidno：12所示；

(7)扩增癌症相关基因her2基因的特异性引物，如seqidno：13和seqidno：14所示；

(8)扩增癌症相关基因er基因的特异性引物，如seqidno：15和seqidno：16所示；

(9)扩增癌症相关基因pgr基因的特异性引物，如seqidno：17和seqidno：18所示；

(10)扩增癌症相关基因bcl2基因的特异性引物，如seqidno：19和seqidno：20所示；

(11)扩增癌症相关基因scube2基因的特异性引物，如seqidno：21和seqidno：22所示引物对；

(12)扩增癌症相关基因mmp11基因的特异性引物，如seqidno：23和seqidno：24所示；

(13)扩增癌症相关基因ctsl2基因的特异性引物，如seqidno：25和seqidno：26所示引物对；

(14)扩增癌症相关基因gstm1基因的特异性引物，如seqidno：27和seqidno：28所示引物对；

(15)扩增癌症相关基因cd68基因的特异性引物，如seqidno：29和seqidno：30所示；

(16)扩增癌症相关基因bag1基因的特异性引物，如seqidno：31和seqidno：32所示；

(17)扩增参考基因actb基因的特异性引物，如seqidno：33和seqidno：34所示；

(18)扩增参考基因gapdh基因的特异性引物，如seqidno：35和seqidno：36所示；

(19)扩增参考基因rplpo基因的特异性引物，如seqidno：37和seqidno：38所示；

(20)扩增参考基因gus基因的特异性引物，如seqidno：39和seqidno：40所示；

(21)扩增参考基因tfrc基因的特异性引物，如seqidno：41和seqidno：42所示。

一种乳腺癌复发风险评估21基因检测试剂盒，该试剂盒中包括seqidno.：1～42所示的引物。

上述乳腺癌复发风险评估21基因检测引物在乳腺癌复发风险评估中的应用在本发明的保护范围之内。

一种乳腺癌复发风险评估21基因检测方法，包括如下步骤：

(1)石蜡组织rna提取；

(2)逆转录；

(3)荧光定量pcr扩增；

(4)结果分析：判断复发预测风险具体按照如下标准：低风险：rs≤18；中风险：18＜rs＜31；高风险：rs≥31。

步骤(2)中，逆转录反应体系为20μl，其中，模板rna11μl，rt酶1μl，ri酶1μl，dntp2μl，5×buffer4μl，随机引物1μl；

逆转录反应条件：42℃30min，95℃5min。

步骤(3)中，荧光定量pcr扩增体系为：pcr反应体系为20μl，其中2×mix10μl，上游与下游混合引物(10μmol/l)0.4μl，模板rna2μl，焦碳酸二乙酯(depc)处理水7.6μl；

荧光定量pcr反应条件为：94℃20s，60℃15s，延伸72度15s，荧光采集点在60℃，反应体积设置为20μl。

所述核酸序列由对16个癌症相关基因和5个参考基因进行扩增检测的21对引物组成。所述癌症相关基因大体分为5类，分别为增殖相关基因(ki67、stk15、survivin、ccnb1和mybl2)、表皮生长因子受体相关基因(grb7和her2)、激素相关基因(er、pgr、bcl2和scube2)、浸润相关基因(mmp11和ctsl2)和3个未分类基因(gstm1、cd68和bag1)。所述5个参考基因分别为actb、gapdh、rplpo、gus和tfrc。

有益效果：

(1)本发明利用荧光定量的优点，具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点。

(2)本发明所涉及的21对引物产出片段都在150bp以内，大大提高了石蜡标本提取mrna逆转录后pcr的效率。

(3)本发明所涉及的21对引物在进行pcr时其扩增条件一致，将大大缩短了检测实验时间。

采用荧光定量聚合酶链式反应同时对乳腺癌复发风险评估的21基因进行扩增检测，从而考虑是否需要辅助化疗等临床治疗措施。该试剂盒及技术方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，通过荧光定量能实现快速检测乳腺癌复发风险评估的21基因，为临床治疗提供参考。

附图说明

图1为2例乳腺癌复发风险评估的21基因检测电泳图，在同一条件下均能扩增出，且均没有引物二聚体的形成。

图2为1例乳腺癌复发风险评估的21基因检测的荧光定量pcr图，其ct值在25-40之间，图中横坐标为循环数；纵坐标为荧光值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：检测乳腺癌复发风险评估的21基因检测的基因的核酸序列。

21对特异性引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：

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实施例2：检测乳腺癌复发风险评估的21基因检测的方法。

仪器：roche480荧光定量pcr检测仪，beckman22r台式微量冷冻离心机，eppendorf5810r台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司wh-866型涡旋振荡器。

(1)石蜡组织rna提取试剂

石蜡组织rna的抽提按照qiagen生物公司生产的石蜡组织rna抽提试剂盒说明书提取，得到组织rna备用。

(2)逆转录，试剂购自thermo公司

反应体系为20μl体系，其中模板rna11μl，rt酶1μl，ri酶1μl，dntp2μl，5×buffer4μl，随机引物1μl；反应条件：42℃30min，95℃5min。

一个标本制备3管。

(3)荧光定量pcr，试剂购自thermo公司。

反应体系为20μl，其中2×mix10μl，上游与下游混合引物(20μmol/l)0.4μl，模板rna2μl，焦碳酸二乙酯(depc)处理水7.6μl。

(a)配置反应液：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置pcr反应液xμl：

x＝(10μl2×mix+0.4μl上下游引物+7.6μldepc水)×(n份样本+1份空白对照)×2。

一对引物配制一管总反应体系，振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每人份18μl分装到96孔pcr反应板中，每个标本重复2次，传至样本制备区备用。

(b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入模板2μl，空白对照孔加入2μl双蒸水，加样过程要求冰上操作。贴好封口膜，3000rpm离心30s，放入仪器进样槽。

(c)rt-pcr扩增：roche480荧光定量pcr仪同时进行乳腺癌复发风险评估21基因检测，反应条件如下：94℃5s，55℃35s，进行40个循环，荧光采集点在55℃，反应体积设置为20μl。保存文件，运行。

(d)结果分析，具体包括如下步骤：

roche480荧光pcr检测仪点击分析，本产品属于荧光检测，荧光信号收集时设在55℃。选取定量模式，进入分析窗口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则的噪音线的最高点(可根据实际情况适当调整)，且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。每次实验空白对照孔无ct值，结果合格。点击计算，自动计算得到每个测试的ct值。

(3)根据乳腺癌复发风险评估公式，将步骤(2)所得的样本的ct值代入公式并加以计算得出一个风险值rs(复发风险评分，从0至100范围。)，判断复发预测风险具体按照如下标准：

低风险：rs≤18；中风险：18＜rs＜31；高风险：rs≥31

以下是10个标本的检测数据，同时采用乳腺癌21基因检测pcr芯片(购自上海杏园生物科技有限公司？)做比较：

根据判断标准，就可预测出乳腺癌复发风险程度，其中有3个低风险，7个高风险。且与基因芯片检测结果一致。

综上所述，本发明利用荧光定量的优点，采用荧光定量聚合酶链式反应同时对乳腺癌复发风险评估的21基因进行扩增检测；本试剂盒具有操作简便快捷、灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点，能较好满足乳腺癌复发风险评估的临床应用，能降低无效用药，提高用药准确率，减少患者经济负担，延长患者生命作出一份贡献。

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<110>温州迪安医学检验所有限公司杭州迪安医学检验中心有限公司

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<223>扩增参考基因tfrc基因的上游引物

<400>41

gccaactgctttcatttgtg20

<210>42

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增参考基因tfrc基因的下游引物

<400>42

actcaggcccatttccttta20