本发明涉及一种改造的木质纤维素酶及其应用，特别涉及包含编码所述改造纤维素酶的核酸序列的基因构建体，从宿主菌株中生产所述改造纤维素酶的方法和用所述改造的纤维素酶在木质素存在的条件下对纤维素水解的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
纤维素是陆地上最主要的光和作用产物，因其具有储藏量大、生产周期短、绿色无污染等特点，降解纤维素获得生物燃料替换日益枯竭的化石原料备受人们的青睐。木质纤维素的降解分为酸降解和纤维素酶降解：自二战至今，酸降解法被证明糖得率低，成本高，设备投资大；而纤维素酶降解法由于潜在成本低，环境友好，糖得率高，被研究者广泛关注。木质纤维素干重的90％是以纤维素、半纤维素、木质素以及果胶的形式存在的(jensen,etal.,2008；
为了降低木质素的抑制作用，往往通过蒸汽爆破、氨处理、酸处理或者有机溶剂处理木质纤维素等方法降低木质素含量或者使得纤维素表面暴露以提高木质纤维素的水解效率。这些物理或者化学处理方法能够很好的提高木质素纤维的降解效率，然而由于木质纤维素结构复杂，往往很难将木质素清除干净，预处理后残留的木质素仍然对木质纤维素的降解产生一定影响。
纤维素酶属于糖苷水解酶，糖苷水解酶往往采取不同模块的组合形式来提高对这些大物质分子的降解能力。一般来说，糖苷水解酶包含一个催化结构域、一个或者几个串联的碳水化合物结合区以及将二者相连的连接区。碳水化合物结合区是独立存在于酶蛋白的区域，他们能够使其所在的蛋白质接近、结合并富集于作用的底物，对促进碳水化合物降解酶的降解活性具有重要作用。真菌纤维素酶的碳水化合物结合区氨基酸序列相似度非常高，有些位点的氨基酸高度保守，例如形成平滑面的三个芳香族氨基酸、29位的天冬酰胺及34位的谷氨酰胺等(linderetal.,1995)。碳水化合物结合区中的芳香类氨基酸(酪氨酸和色氨酸)形成光滑的疏水面与碳水化合物中的吡喃糖环结构通过疏水作用相互结合(simpsonetal.,2000)。研究表明，除了三个芳香族氨基酸外，极性氨基酸，例如q7、n29和q34等同样参与了疏水面的形成(fukudaetal.,2006；beckhametal.,2010)。同时，极性氨基酸产生的氢键作用同样在结合中发挥作用(hildenandjohansson,2004)，并且这些极性氨基酸位点的突变可能会影响疏水面的形成，降低纤维素酶与纤维素的结合活性，从而降低了纤维素酶活性。strobel(2015)等利用研究表明，当碳水化合物结合区平滑面中的芳香族氨基酸或者极性氨基酸突变为丙氨酸后，里氏木霉cbhi对纤维素和木质素的亲和力同时降低；同时他们指出，除个别氨基酸外，碳水化合物结合区点突变对纤维素及木质素的吸附能力变化高度的一致。
然而，碳水化合物结合区除了能够识别、吸附纤维素链之外，还能够与木质素非特异性的吸附，并且木质素与碳水化合物结合区的吸附性非常强。因此如何降低纤维素酶与木质素的非特性吸附对提高纤维素酶降解活性、降低燃料乙醇生产成本具有重要意义。通常来说，木质素表面携带有大量的负电荷。lan(2013)等的研究表明，ph对纤维素酶水解木质纤维素产生影响，较高的ph(5.2-6.2)条件下木质纤维素的水解效率高于ph在4.8或者5.0时。高ph时的水解效率，木质素表面携带的负电荷增加，同时亲水性提高，这降低了纤维素酶与木质素的非特异性的吸附作用。提高反应体系的ph值时，由于纤维素酶的pi较低，其表面所携带的负电荷增加，因此纤维素酶与木质素之间的电荷相斥作用增强，同样使得纤维素酶与木质素非特异性吸附降低(louetal.,2013)。同时有报道表明(strobeletal.,2016)，增加碳水化合物结合区区负电荷突变时，碳水化合物结合区对木质素的吸附降低。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供一种改造的木质纤维素酶及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种改造的木质纤维素酶，在碳水化合物结合区进行如下改造：
碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者，碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸；
所述的碳水化合物结合区属于糖水化合物结合区第一家族，与来自木霉属(trichodermasp.)、曲霉属(aspergillussp.)、青霉属(penicilliumsp.)、肉座菌属(hypocreasp.)、腐质霉属(humicolasp.)、支顶孢属(acremoniumsp.)、裸节菌属(talaromycessp.)或者脉孢菌属(neurosporasp.)的cel5a、cel6a、cel7a、cel7b纤维素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物结合区具有高于70％的同源性。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区的氨基酸序列如seqidno.1所示。所述碳水化合物结合区的表达基因核苷酸序列如seqidno.13所示。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。
进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如seqidno.8所示。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.3所示。
进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如seqidno.9所示。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.4所示。
进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如seqidno.10。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.5所示。
进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如seqidno.11所示。
根据本发明优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.6所示。
进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如12所示。
上述改造的木质纤维素酶在木质素存在的条件下水解纤维素的应用。
改造原理
本发明所述改造后的碳水化合物结合区能够使得木质素对纤维素酶的抑制作用降低，从而增加了在木质素存在条件下的纤维素水解活性。具体地，本发明涉及包含碳水化合物结合区的纤维素酶，所述改造碳水化合物结合区能够与催化结构域通过连接区进行可操作地连接，所述改造的碳水化合物结合区的长度约为40个氨基酸，包含一个或多个氨基酸的替换。所述氨基酸的替换导致相对于衍生出所述改造碳水化合物结合区的亲本碳水化合物，具有使碳水化合物结合区的理论等电点下降，并且/或者使所述碳水化合物结合区的表面负电荷增加，并且/或者使所述碳水化合物中的天冬氨酸含量增加；所述氨基酸的替换是通过用酸性氨基酸天冬氨酸替换衍生出所述改造碳水化合物结合区的亲本碳水化合物结合区的丝氨酸和/或苏氨酸。所述氨基酸替换导致所述碳水化合物结合区的理论等电点下降至少1.3单位并且/或者使所述碳水化合物结合区中的天冬氨酸比例提高了至少27％。
有益效果
1、本发明所述改造的碳水化合物结合区使得与包含亲本碳水化合物结合区的亲本纤维素酶相比，水解活性提高，亲本碳水化合物结合区可操作地通过连接区与所述纤维素酶中存在的相同的纤维素酶催化结构域相连；
2、本发明所所述改造的碳水化合物结合区可使得与亲本纤维素酶相比，在木质素存在的条件下纤维素水解活性提高至少约14％，这种在木质素存在条件下的纤维素酶活性升高对从木质纤维素底物生产可发酵糖、醇或糖醇例如从纤维素生产乙醇的工业具有潜在价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
菌种来源
里氏木霉(trichodermareesei)qm6a或其变异菌种为原始菌，来源于美国模式培养物集存库(atcc)，菌种保藏号atcc13631。
e.colistraingb05-dir，克隆载体pug6和psilent-1均购自山东大学微生物技术国家重点实验室。
β-葡萄糖苷酶根据wang等,2015,aweibullstatistics‐basedlignocellulosesaccharificationmodelandabuilt‐inparameteraccuratelypredictlignocellulosehydrolysisperformance.biotechnologyjournal,10(9):1424-1433的方法获得。
大肠杆菌trans5α和transbl21(de3)以及表达载体pet-22b均购自北京全式金公司；
实施例1描述了在以下实施例中所用到的菌种及载体，实施例2～6详细的描述了本发明中改造的里氏木霉cel7a突变体及其纯化的过程，实施例7、8详细的描述了在实施过程中使用的β-葡萄糖苷酶的表达与纯化，实施例9描述了酸不溶性木质素的制备过程，实施例10描述了经过本发明改造后的cel7a突变体水解活性的提高。
实施例1里氏木霉纤维二糖水解酶i(cel7a)编码基因在载体pug6中的克隆
cel7a编码基因及其上下游片段经pcr的方法在里氏木霉qm6a中克隆获得；引物序列如下：
f1:gcaaatggtacgtacggacagttcaggccgcggatctgccggtctcccta
r1:tgcggttgtgcgaccttcagctctggcgttctatagtgtcacctaaatcg
pcr反应在50μl体系中进行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f11.5μl，引物r11.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加纯水补足到50μl。
pcr反应程序如下：
94℃预变性2min；98℃变性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸10min。
潮霉素抗性基因，引物序列如下：
f2:cgatttaggtgacactatagaacgccagagctgaaggtcgcacaaccgca
r2:atcgatccggtcggcatctactctattacaggcactgagagtagtaaggg
pcr反应在50μl体系中进行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f21.5μl，引物r21.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加纯水补足到50μl。
pcr反应程序如下：
94℃预变性2min；98℃变性10s，67℃退火30s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸10min。
pgpd/tter经pcr的方法从载体psilent中克隆获得，引物序列如下：
f3:cccttactactctcagtgcctgtaatagagtagatgccgaccggatcgat
r3:tagggagaccggcagatccgcggcctgaactgtccgtacgtaccatttgc
pcr反应在50μl体系中进行：2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f31.5μl，引物r31.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加纯水补足到50μl。
pcr反应程序如下：
94℃预变性2min；98℃变性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30个循环；68℃延伸10min。
获得上述片段后，在gb05-dir菌中用linear-linearhomologousrecombinationmediatedbyfulllengthrecet方法(fu等,2012,full-lengthreceenhanceslinear-linearhomologousrecombinationandfacilitatesdirectcloningforbioprospecting.naturebiotechnology30(5):440-446.)构建获得cel7a克隆质粒ptci，经检测，cel7a编码基因的核苷酸序列如seqidno.14所示。
实施例2：碳水化合物结合区的点突变
使用点突变试剂盒kod-plus-mutagensiskit(购自日本东洋纺绩株式会社)对构建的质粒ptci中cel7a的碳水化合物结合区进行点突变，突变方法严格按照试剂盒说明书操作，突变后的质粒在大肠杆菌trans5α中进行扩增。点突变引物序列如下：
s14d-f:gtattggctacgatggccccacgg
s14d-r:cgccgcactggccgtagtgagact
s21d-f:ggtctgcgccgatggcacaacttg
s21d-r:gtggggccgctgtagccaataccg
t24d-f:ccagcggcacagattgccaggtcct
t24d-r:cgcagaccgtggggccgctgtagc
经过此步骤共获得五个含有碳水化合物结合区不同位点突变的质粒：s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
经测序，s14d质粒的碳水化合物结合区表达后第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸，木质纤维素酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
经测序，s21d质粒的碳水化合物结合区表达后第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸，木质纤维素酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。
经测序，t24d质粒的碳水化合物结合区表达后第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸，木质纤维素酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。
经测序，s14d/s21d质粒的碳水化合物结合区表达后第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸，木质纤维素酶的氨基酸序列如seqidno.5所示。
经测序，s14d/s21d/t24d质粒的碳水化合物结合区表达后第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸，木质纤维素酶的氨基酸序列如seqidno.6所示。
实施例3：里氏木霉cel7a中碳水化合物结合区的改造
在实施例2中构建获得的碳水化合物结合区突变后的质粒经测序验证正确后，在大肠杆菌trans5α中进行大量克隆扩增，获得的质粒通过同源重组的方法转化里氏木霉qm6a的原生质体，构建获得含有碳水化合物结合区目的位点突变的cel7a表达菌株。原生质体制备及转化方法参照丝状真菌转化方法(liu等,2016,regulationofcellulaseexpression,sporulation,andmorphogenesisbyvelvetfamilyproteinsintrichodermareesei.appliedmicrobiologyandbiotechnology100(2):769-779.)。构建获得的转化子用引物对f4/r4进行验证，野生型基因组中扩增获得的片段大小为2121bp，转化子基因组中扩增获得的片段大小为3660bp。获得的转化子cel7a中碳水化合物结合区送交基因公司进行测序验证。f4/r4引物序列如下：
f4:cctcatgctctccccatctactca
r4:gtggtactgggatacacgaagagc
经过此步骤共获得五个含有碳水化合物结合区不同位点突变cel7a突变体的qm6a株，碳水化合物结合区突变位点包括s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
实施例4：cel7a及其突变体在里氏木霉中的表达
上述构建获得含有碳水化合物结合区突变位点的cel7a及野生型cel7a在里氏木霉qm6a中进行培养表达。首先将各菌株在麸皮培养基中培养5～7天，待其生孢后，接种至种子培养基中进行培养；3天后，按照1:10(v/v)的比例将经过种子培养阶段的菌液接种至产酶培养基中进行诱导培养；产酶培养7天后即可收集酶液。
麸皮培养基的配制(100ml)：称取麸皮1g、玉米芯1g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、硫酸铵0.2g、磷酸二氢钾0.3g、七水硫酸镁0.09g和碳酸钙0.5g于300ml三角瓶中，并添加适量微量元素，加入100ml纯净水后灭菌备用。
产酶培养基的配制(200ml)：称取麸皮6g、玉米芯6g、微晶纤维素1.2g、蛋白胨1g、尿素0.2g、硫酸铵0.8g、磷酸二氢钾0.6g、七水硫酸镁0.18g、硝酸钠0.4g和碳酸钙1g于1l三角瓶中，并添加适量微量元素，加入200ml纯净水后，吸取0.6ml吐温-80并沿培养基液面缓缓加入，灭菌备用。
实施例5：cel7a及其突变体的纯化
实施例4中培养的酶液经离心后去除杂质，收集上清液(酶液)。
(1)收集后的酶液用浓缩管浓缩，于4℃条件下5000g离心，直至将酶液浓缩至约3ml；
(2)吸取浓缩后的酶液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min去除不溶物，吸取上清酶液于1.5ml离心管中，至于冰上备用；
(3)提前用50mm的tris-hcl缓冲液冲洗分子筛s-400，系统流速设为0.5ml/min，柱前压设为0.5mpa，delta压设置为0.3mpa，冲洗大于2倍柱体积(240ml)的缓冲液；
(4)用2.5ml注射器取2ml浓缩酶液上样；
(5)收集洗脱峰蛋白，sds-page电泳检测蛋白；
(6)取电泳检测条带大小合适，纯度高的蛋白使用除盐柱更换蛋白buffer，使用柠檬酸缓冲液(ph4.8)进行洗脱；
(7)收集获得的蛋白质浓度使用bradfordkit蛋白浓度试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)进行测定，标准曲线及测定方法参照试剂盒说明书。
实施例6：酸不溶性玉米秸秆木质素的制备
取50g玉米秸秆经球磨后加入丙酮(玉米秸秆：丙酮的质量比为1:10)浸泡24h，用水冲洗10次，烘干后加入37％以上的浓盐酸(料：盐酸的质量比为1:10)，冰浴处理24h，用水冲洗10次。烘干后加入足量的纤维素酶酶液(蔚蓝生物科技有限公司提供)于45℃处理7天。处理结束之后加入1％(w/v)sds，37℃处理1h使纤维素酶变性，121℃处理1h，用热水反复冲洗10次，烘干后即获得酸不溶性玉米秸秆木质素(acidinsolublecornstoverlignin，aics-lignin)。获得的木质素用两步酸法分析木质素中纤维素和半纤维素的含量，结果表明制备的木质素纤维素含量非常低(0.7％)、半纤维素没有检测到，满足木质素使用要求。
实施例7：cel7a及其突变体的水解活性检测
将实施例5中纯化获得的cel7a及其突变体、微晶纤维素(购自国药集团化学试剂有限公司)以及实施例6中制备的木质素在柠檬酸缓冲液(ph4.8，45℃)并添加少量的葡萄糖苷酶中进行旋转孵育48小时。每一个反应体系中含有60μgcel7a或者其突变体、15μg的β-葡萄糖苷酶、30mg微晶纤维素以及15mgaics-lignin(见实施例6)，使用柠檬酸缓冲液补足至1ml；每个反应体系重复两次。反应体系经48小时反应后，离心收集上清液，经hplc分析上清液中葡萄糖的含量。
结果表明，cel7a野生型反应体系中葡萄糖的浓度为6.2mg/ml，碳水化合物结合区s14d突变后的cel7a反应体系中葡萄糖的浓度为6.4mg/ml，碳水化合物结合区s21d突变后的cel7a反应体系中葡萄糖的浓度为7.3mg/ml，碳水化合物结合区t24d突变后的cel7a反应体系中葡萄糖的浓度为7.8mg/ml，碳水化合物结合区s14d/s21d突变后的cel7a反应体系中葡萄糖的浓度为8.3mg/ml，碳水化合物结合区s14d/s21d/t24d突变后的cel7a反应体系中葡萄糖的浓度为8.8mg/ml。以野生型cel7a获得的葡萄浓度为100％进行比较，其他突变体水解活性提高效率见表1。由表1可以看出，碳水化合物结合区中s21d突变后，cel7a水解活性提高了18％，t24d突变后提高了26％，双位点突变s14d/s21d突变后cel7a水解活性提高了34％，而三位点突变s14d/s21d/t24d突变后cel7a水解活性提高了42％，结果如表1所示。
表1改造前后cel7a水解纤维素活性的比较
参考文献
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