本发明属于大蒜深加工技术领域，具体涉及一种大蒜素合成阿霍烯的工艺方法及其制备方法。
背景技术：
大蒜素(大蒜新素、garlicin)为三硫代烯丙醚类化合物，天然存在于百合科植物大蒜的鳞茎中。对多种革兰氏阳性和阴性菌均有抗菌作用，对杆菌(痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、百日咳杆菌)、真菌(白色念珠菌、隐球菌、烟曲霉菌)、病毒(巨细胞病毒)、阿米巴原虫、阴道滴虫、蛲虫等均有抑制杀灭作用，尤其对大肠杆菌、痢疾杆菌等肠道细菌作用强。
但是，大蒜素极不稳定，在常温条件就会分解。阿霍烯作为源自于大蒜的一种活性成分，较之蒜素更加稳定且不具有令人难以接受的蒜辣蒜臭气味，具有抗血栓形成，诱导肿瘤细胞调亡及抗菌消炎等特别的生理功效，是一种天然高效的活性成分。但是大蒜素在在丙酮/水体系中，分解产物主要为e/z-阿霍烯。这些分解产物导致了大蒜素转化为阿霍烯反应的的复杂性，有大量的副反应发生，不利于阿霍烯的合成。
发明的内容
本发明解决的技术问题是，大蒜素在在丙酮/水体系中，分解产物主要为e/z-阿霍烯。这些分解产物导致了大蒜素转化为阿霍烯反应的的复杂性，有大量的副反应发生，不利于阿霍烯的合成。
为解决上述问题，本发明针对大蒜素裂解反应的特点，项目采用络合催化反应的形式，将大蒜素用亲水络合物络合以提高大蒜素的稳定，在反应时解络合，这样大蒜素及时反应生成阿霍烯，避免了大量的副反应发生。
本发明的技术方案如下：
一种大蒜素合成阿霍烯的工艺方法，由以下步骤组成：
(1)蒜酶提取：将加入蒜酶提取液的大蒜用胶体磨研磨得到大蒜浆，离心分离出上清液；在-5℃～5℃条件下，将硫酸铵加入上清液中，边添加边搅拌，然后分离出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，边添加边搅拌，离心分理出沉淀，重溶，离心后得到上清液；本发明根据固定化酶固定化工艺的要求和工业用酶的特定，建立合适大规模应用的酶纯化工艺。以酶活收率、酶比活力为指标考察蒜酶纯化过程中浸提液组分,根据大蒜蒜酶的酶学性质，分别选用盐析法、有机聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；确定最适硫酸铵浓度、peg8000浓度。
(2)蒜酶纯化：将步骤(1)得到的上清液超滤，清液依次经分子量由大到小的分子超滤膜进行2-3级过滤分离，首次过滤使用的分子超滤膜为分子量200000，末级分子超滤膜的分子量为15000-5000；将现代超滤技术取代透析技术应用于蒜酶的提取纯化工艺。超滤工艺中主要在于根据粗酶液中蒜酶及其中杂蛋白分子量的大小，选择一组或多组分子量的超滤膜，以达到去除各种杂蛋白的目的。另一方面，由于酶容易在剧烈条件下变性，在研究中，分别考察以离心泵、柱塞泵、隔膜泵为动力的分离条件下，对酶活力的影响来选择适用于蒜酶超滤分离的泵。
(3)蒜酶固定化：分别将磷酸氢二钾/钠与氯化钙分别溶于水中配成水溶液待用，再将步骤(2)得到的蒜酶加入到氯化钙水溶液中，调节ph为5-9，搅拌均匀后，加入磷酸氢二钾/钠的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶；通过对蒜酶功能学的研究，以酶吸附率、固定化酶比活力、固定化酶稳定性等指标，确定适合蒜酶的固定化方式。
(4)制备大蒜素：在-5℃～5℃、ph为4-6的条件下，将步骤(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比为1:1-1:5，得到的产物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素备用；将固定化蒜酶装配成生物反应器，通过正交试验考察反应温度、ph等对蒜氨酸转化率的影响，以确定最佳反应条件。
(5)合成阿霍烯：配置β-环糊精水溶液，与步骤(4)得到的大蒜素混合，得到悬浮物，将混合物加热反应，然后烘干、粉碎过筛得到含阿霍烯包合物。
(6)阿霍烯纯化：将步骤(5)得到的阿霍烯包合物用极性有机溶剂提取，回收溶剂得阿霍烯。
进一步的，所述步骤(1)中蒜酶提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液。
进一步的，所述步骤(1)中络合剂为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂为巯基丙醇；缓冲剂为磷酸盐。
进一步的，所述步骤(1)中硫酸铵的添加量为20％-30％，聚乙二醇的添加量为30％-50％。
进一步的，所述步骤(1)离心条件3000-5000×g，30min。
进一步的，所述步骤(3)磷酸氢二钾/钠水溶液浓度浓度为1m，氯化钙水溶液浓度为1m。
进一步的，所述步骤(5)中β-环糊精水溶液中β-环糊精与水的料液比为1:1-1:5，反应温度30℃～70℃。
进一步的，所述步骤(6)中极性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮，提取料液比例为1:4-1:6，提取热温度30℃～90℃。
本发明具有以下有益效果：
1、采用固定化酶技术固定蒜酶，在生物反应器中，催化蒜氨酸转化为大蒜素，反应专一性好，催化效率高，可以获得高纯度的大蒜素产品。
2、采用络合催化反应，避免大量副反应产生，保证了阿霍烯的高收率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种大蒜素合成阿霍烯的工艺方法，由以下步骤组成：
(1)蒜酶提取：将加入蒜酶提取液的大蒜用胶体磨研磨得到大蒜浆，离心分离出上清液；在0℃条件下，将硫酸铵加入上清液中，边添加边搅拌，然后分离出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，边添加边搅拌，离心分理出沉淀，重溶，离心后得到上清液；本发明根据固定化酶固定化工艺的要求和工业用酶的特定，建立合适大规模应用的酶纯化工艺。以酶活收率、酶比活力为指标考察蒜酶纯化过程中浸提液组分,根据大蒜蒜酶的酶学性质，分别选用盐析法、有机聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；确定最适硫酸铵浓度、peg8000浓度。所述步骤(1)中蒜酶提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液；络合剂为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂为巯基丙醇；缓冲剂为磷酸盐。所述步骤(1)中硫酸铵的添加量为25％，聚乙二醇的添加量为40％。离心条件4000×g，30min。
(2)蒜酶纯化：将步骤(1)得到的上清液超滤，清液依次经分子量由大到小的分子超滤膜进行2级过滤分离，首次过滤使用的分子超滤膜为分子量200000，末级分子超滤膜的分子量为10000；
(3)蒜酶固定化：分别将磷酸氢二钾/钠与氯化钙分别溶于水中配成水溶液待用，再将步骤(2)得到的蒜酶加入到氯化钙水溶液中，调节ph为7，搅拌均匀后，加入磷酸氢二钾/钠的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶；所述步骤(3)磷酸氢二钾/钠水溶液浓度为1m，氯化钙水溶液浓度为1m。
(4)制备大蒜素：在0℃、ph为5的条件下，将步骤(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比为1:3，得到的产物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素备用。
(5)合成阿霍烯：配置β-环糊精水溶液，与步骤(5)得到的大蒜素混合，得到悬浮物，将混合物加热反应，然后烘干、粉碎过筛得到含阿霍烯包合物。所述步骤(5)中β-环糊精水溶液中β-环糊精与水的料液比为1:3。
(6)阿霍烯纯化：取步骤(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:4加入乙醇，加热至60℃搅拌提取1h，过滤，滤液减压回收溶剂得阿霍烯，含量为82.3％。
实施例2：
一种大蒜素合成阿霍烯的工艺方法，由以下步骤组成：
(1)蒜酶提取：将加入蒜酶提取液的大蒜用胶体磨研磨得到大蒜浆，离心分离出上清液；在-5℃条件下，将硫酸铵加入上清液中，边添加边搅拌，然后分离出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，边添加边搅拌，离心分理出沉淀，重溶，离心后得到上清液；本发明根据固定化酶固定化工艺的要求和工业用酶的特定，建立合适大规模应用的酶纯化工艺。以酶活收率、酶比活力为指标考察蒜酶纯化过程中浸提液组分,根据大蒜蒜酶的酶学性质，分别选用盐析法、有机聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；确定最适硫酸铵浓度、peg8000浓度。所述步骤(1)中蒜酶提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液；络合剂为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂为巯基丙醇；缓冲剂为磷酸盐。所述步骤(1)中硫酸铵的添加量为20％，聚乙二醇的添加量为30％-。离心条件5000×g，30min。
(2)蒜酶纯化：将步骤(1)得到的上清液超滤，清液依次经分子量由大到小的分子超滤膜进行2级过滤分离，首次过滤使用的分子超滤膜为分子量200000，末级分子超滤膜的分子量为15000。
(3)蒜酶固定化：分别将磷酸氢二钾/钠与氯化钙分别溶于水中配成水溶液待用，再将步骤(2)得到的蒜酶加入到氯化钙水溶液中，调节ph为5，搅拌均匀后，加入磷酸氢二钾/钠的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶。所述步骤(3)磷酸氢二钾/钠水溶液浓度浓度为1m，氯化钙水溶液浓度为1m。
(4)制备大蒜素：在5℃、ph为4的条件下，将步骤(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比为1:5，得到的产物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素备用。
(5)配置β-环糊精水溶液，与步骤(5)得到的大蒜素混合，得到悬浮物，将混合物加热反应，然后烘干、粉碎过筛得到含阿霍烯包合物。所述步骤(5)中β-环糊精水溶液中β-环糊精与水的料液比为1:1。
(6)阿霍烯纯化：取步骤(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:5加入乙醇，加热至45℃搅拌提取1h，过滤，滤液减压回收溶剂得阿霍烯，含量为78.8％。
实施例3：
一种大蒜素合成阿霍烯的工艺方法，由以下步骤组成：
(1)蒜酶提取：将加入蒜酶提取液的大蒜用胶体磨研磨得到大蒜浆，离心分离出上清液；在5℃条件下，将硫酸铵加入上清液中，边添加边搅拌，然后分离出第二清液；再向第二清液中加入聚乙二醇，边添加边搅拌，离心分理出沉淀，重溶，离心后得到上清液；本发明根据固定化酶固定化工艺的要求和工业用酶的特定，建立合适大规模应用的酶纯化工艺。以酶活收率、酶比活力为指标考察蒜酶纯化过程中浸提液组分,根据大蒜蒜酶的酶学性质，分别选用盐析法、有机聚合物沉淀法提粗酶液中的大蒜蒜酶；确定最适硫酸铵浓度、peg8000浓度。所述步骤(1)中蒜酶提取液为含有络合剂、抗氧剂、缓冲剂及丙三醇的水溶液；络合剂为乙二胺四乙酸二钠；抗氧剂为巯基丙醇；缓冲剂为磷酸盐。所述步骤(1)中硫酸铵的添加量为30％，聚乙二醇的添加量为50％。离心条件3000×g，30min。
(2)蒜酶纯化：将步骤(1)得到的上清液超滤，清液依次经分子量由大到小的分子超滤膜进行2级过滤分离，首次过滤使用的分子超滤膜为分子量200000，末级分子超滤膜的分子量为15000。
(3)蒜酶固定化：分别将磷酸氢二钾/钠与氯化钙分别溶于水中配成水溶液待用，再将步骤(2)得到的蒜酶加入到氯化钙水溶液中，调节ph为9，搅拌均匀后，加入磷酸氢二钾/钠的水溶液，得到的沉淀即固定化的蒜酶。所述步骤(3)磷酸氢二钾/钠水溶液浓度浓度为1m，氯化钙水溶液浓度为1m。
(4)制备大蒜素：在-5℃、ph为6的条件下，将步骤(3)得到的固定化蒜酶加入到蒜氨酸溶液中，料液比为1:5，得到的产物用乙醇萃取，萃取得到的大蒜素备用。
(5)合成阿霍烯：与步骤(5)得到的大蒜素混合，得到悬浮物，将混合物加热反应，然后烘干、粉碎过筛得到含阿霍烯包合物。所述步骤(5)中β-环糊精水溶液中β-环糊精与水的料液比为1:1。
(6)阿霍烯纯化：取步骤(5)的含阿霍烯包合物，按料液比1:3加入乙醇，加热至30℃搅拌提取1h，过滤，滤液减压回收溶剂得阿霍烯，含量为76.4％。