本申请涉及致病菌的检测技术领域，特别涉及一种高灵敏度快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其属于微生物学与化学交叉技术领域。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病性和致死性的病原菌，可引起局部化脓感染，坏死性肺炎、心包炎和食物中毒等一系列疾病，甚至出现脓毒症、败血症等全身感染。因此快速有效的检测技术成为预防的关键。
随着科技的发展，各种新技术应用于金黄色葡萄球菌的检测，发展了免疫学方法、电化学法、pcr等方法，但是这些方法存在易污染、选择性弱、操作繁琐和所需设备昂贵等缺点，难以满足临床快速诊断治疗和食品检测的需要。与电化学传感器和pcr等检测方法相比，利用荧光比色法检测金黄色葡萄球菌的方法具备操作简单、成本低、不需要特殊昂贵的设备等优点。但是单一的基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，fret)原理检测靶标的灵敏度比较低。dna/go(脱氧核糖核酸/氧化石墨烯)传感器和适配体/单臂碳纳米管传感器检测致病菌的检测下限分别为高于102cfu/ml和103cfu/ml。尽管它们操作方便、速度快，但是检测下限不尽如人意。而且以dna为靶标设计的传感器，在提取菌体的总dna后，还需将双链dna变性成单链后才能加入到检测体系中，增加了检测工序，延长检测时间。
技术实现要素：
本申请的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，以解决金黄色葡萄球菌检测灵敏度低和检测时间长的问题。
根据本申请的实施例，提供了一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤一、将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素标记的双荧光标记探针；
所述第一探针的dna序列为5’-fam-tctaga-3’；
所述第二探针的dna序列为5’-tctaga-fam-3’；
所述单链dna的序列为5’-tctagaagttatcccagtcttataggtaggttcatga-3’；
步骤二、将所述双荧光标记探针与氧化石墨烯溶液混合形成复合液；
步骤三、提取待测菌液的总rna；
步骤四、将所述总rna和脱氧核糖核酸酶同时加入所述复合液中形成混合液，孵化所述混合液；
步骤五、测定孵化后混合液的荧光值，根据所述荧光值计算金黄色葡萄球菌的浓度。
进一步地，所述将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素的双荧光标记探针，包括：
将所述第一探针、所述第二探针及所述单链dna分别在95℃水浴5min后，冰浴10min；
将冰浴后的所述第一探针、所述第二探针及所述单链dna在室温下混合孵育30min，组建成所述双荧光标记探针。
进一步地，所述氧化石墨烯溶液制备方法包括：
将氧化石墨烯溶于超纯水，在300w超声波破碎仪下冰浴超声120min。
优选地，所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.09mg/ml。
进一步地，所述提取待测菌液的总rna包括：
将所述待测菌液冷冻离心得到菌体；
提取所述菌体的总rna。
进一步地，所述冷冻离心的离心力是1700g。
优选地，步骤四中所述孵化的时间为50min。
由以上技术方案可知，本申请提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括：将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素标记的双荧光标记探针；将所述双荧光标记探针与氧化石墨烯溶液混合形成复合液；提取待测菌液的总rna；将所述总rna和脱氧核糖核酸酶同时加入所述复合液中形成混合液，孵化所述混合液；测定孵化后的所述混合液的荧光值，根据所述荧光值计算金黄色葡萄球菌的浓度。本申请实施例以一段特异性识别的金黄色葡萄球菌16srrna为靶标设计探针，基于荧光叠加原理构建双荧光标记探针/氧化石墨烯体系，并利用脱氧核糖核酸酶的特性使靶标循环检测，放大荧光信号，提高金黄色葡萄球菌检测的灵敏度。传统的检测方法，一个靶标只能产生一个荧光分子，本申请实施例采用了双荧光分子标记法，使荧光强度增大，并通过脱氧核糖核酸酶降解dna的特性，靶标分子能循环被检测，产生多个荧光分子，从而大幅度的降低了金黄色葡萄球菌的的检测下限。本申请实施例将靶标与脱氧核糖核酸酶同时加入，检测时一边识别靶标，一边进行酶切作用，大大提高检测效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本申请实施例示出的一种金黄色葡萄球菌的检测方法流程图；
图2为根据本申请实施例示出的一种金黄色葡萄球菌的检测方法反应过程示意图；
图3为tfp与go比例优化结果；
图4为荧光恢复反应时间的优化；
图5为不同复合物的荧光曲线；
图6为不同靶标rna序列浓度的荧光曲线；
图7为靶标rna序列浓度与荧光值的关系；
图8为不同靶标菌浓度的荧光曲线；
图9为靶标菌浓度与荧光值的关系；
图10为细菌种类与荧光值的关系。
图示说明：
其中，ⅰ-加入双荧光标记探针(tfp)的荧光曲线，ⅱ-加入tfp和氧化石墨烯(go)的荧光曲线，ⅲ-加入tfp、go和脱氧核糖核酸酶(dnasei)的荧光曲线，ⅳ-加入tfp、go和靶序列(target)的荧光曲线，ⅴ-加入tfp、go、dnasei和target的荧光曲线，ⅵ–加入第一单荧光探针(sfp1)、go、dnasei和target的荧光曲线，ⅶ-加入第二单荧光探针(sfp2)、go、dnasei和target的荧光曲线，1-金黄色葡萄球菌，2-大肠杆菌k88，3-铜绿假单胞菌，4-肠炎沙门氏菌，5-鼠伤寒沙门氏菌，6-猪霍乱沙门氏菌，7-枯草芽孢杆菌，8-副溶血性弧菌，9-溶血性弧菌，10-甲型副伤寒沙门氏菌，11-空白。
具体实施方式
参阅图1，本申请实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤s1、将第一探针、第二探针及单链dna(ssdna)组建成带有两个羧基荧光素(fam)的双荧光标记探针(tfp)；
所述第一探针的dna序列为5’-fam-tctaga-3’；
所述第二探针的dna序列为5’-tctaga-fam-3’；
所述单链dna的序列为5’-tctagaagttatcccagtcttataggtaggttcatga-3’；
所述将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素的双荧光标记探针，包括：
将50nm的第一探针、第二探针及单链dna分别在95℃水浴下变性5min后，冰浴10min；将冰浴后的第一探针、第二探针及单链dna三者在室温下混合孵育30min，形成带有两个羧基荧光素标记的双荧光标记探针。
步骤s2、将所述双荧光标记探针(tfp)与氧化石墨烯(go)溶液混合形成复合液；
称取100mggo溶于100ml超纯水，将其置于300w超声波破碎仪下冰浴超声120min充分均匀分散，制备成1mg/ml的go溶液，室温保存备用。
步骤s3、提取待测菌液的总rna；
本申请实施例利用一段特异性识别的金黄色葡萄球菌16srrna为靶标设计探针，其中靶序列是5’-accuaccuauaagacugggauaacu-3’。
将所述待测菌液冷冻离心得到菌体；其中，冷冻离心的离心力是1700g；用总rna提取试剂盒提取所述菌体的总rna。
步骤s4、将所述总rna和脱氧核糖核酸酶同时加入所述复合液中形成混合液，孵化所述混合液；
步骤s5、测定孵化后的所述混合液的荧光值，根据所述荧光值计算金黄色葡萄球菌的浓度。其中，荧光测定的激发波长495nm，发射波长520nm。
参阅图2，本申请设计的ssdna包含能捕捉16srrna靶标的dna序列；同时，ssdna序列的5’-端和3’-端各有6个碱基，可分别与第一探针及第二探针互补。ssdna与第一探针、第二探针互补配对形成两个荧光分子标记的探针(tfp)。当不存在靶标时，tfp通过π-π键吸附在go表面，由于能量共振转移(fret)，荧光被淬灭。当加入靶标rna时，tfp从go表面解离下来与靶标rna互补配对，因此体系荧光值恢复。当核酸分子从go表面解离下来后，dnasei随机降解双链dna(dsdna)、ssdna分子，从而释放靶标rna参与下一轮反应，产生更多自由的fam，荧光信号放大。因此该过程能有效的提高金黄色葡萄球菌检测方法的灵敏度，可以在靶标菌浓度较低的条件下进行定量分析。
由以上技术方案可知，本申请提供一种金黄色葡萄球菌检测方法，包括：将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素标记的双荧光标记探针；将所述双荧光标记探针与氧化石墨烯溶液混合形成复合液；提取待测菌液的总rna；将所述总rna和脱氧核糖核酸酶同时加入所述复合液中形成混合液，孵化所述混合液；测定孵化后的所述混合液的荧光值，根据所述荧光值计算金黄色葡萄球菌的浓度。本申请实施例以一段特异性识别的金黄色葡萄球菌16srrna为靶标设计探针，基于荧光叠加原理构建双荧光标记探针/氧化石墨烯体系，并利用脱氧核糖核酸酶的特性使靶标循环检测，放大荧光信号，提高金黄色葡萄球菌检测的灵敏度。传统的检测方法，一个靶标只能产生一个荧光分子，本申请实施例采用了双荧光分子标记法，使荧光强度增大，并通过dnasei降解dna的特性，靶标分子能循环被检测，产生多个荧光分子，从而大幅度的降低了金黄色葡萄球菌的的检测下限。本申请实施例将靶标与dnasei同时加入，检测时一边识别靶标，一边进行酶切作用，大大提高检测效率，检测所需时间不到2h。
优选地，步骤s2中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.09mg/ml。
为了优化荧光受体go与荧光供体tfp比例，设置从0到0.12mg/ml的13种不同的go浓度。将不同体积的1mg/mlgo溶液分别与tfp缓冲液混合用tris-hcl(ph7.4)定容至100μl，tfp终浓度为50nm，室温孵化20min。在激发波长495nm，发射波长520nm，测定tfp原始荧光值(f0)和tfp/go混合液荧光值(f)。
参阅图3，图3示出了tfp加入不同浓度go的荧光淬灭率的变化。随着go浓度的增大，荧光强度降低，荧光淬灭率迅速上升，直到go浓度达到0.09mg/ml时，荧光淬灭率超过95％，继续增加go浓度，淬灭率基本不变。结果表明，go浓度为0.09mg/ml，所有的荧光标记探针全部吸附到go表面，荧光被淬灭，背景值极低。后续实验均采用此go浓度。
优选地，步骤s4中，所述孵化的时间为50min。
将40nm靶标序列和1udnasei同时加入到tfp/go混合体系中室温孵化，每隔5min监测一次荧光强度来确定体系的最佳荧光恢复反应时间。
参阅图4，图4示出了不同孵化时间荧光值的变化，检测时由于dnasei的作用，时间越长产生的自由荧光分子越多，为提高检测效率，对荧光恢复时间进行优化。当靶标加入体系后，荧光强度逐渐恢复。当荧光恢复反应50min后，荧光值基本趋于平缓，不再显著增加。因此我们将50min作为最佳的荧光恢复反应时间。
为了验证tfp/go的可行性，设置了以下7组溶液：(ⅰ)tfp；(ⅱ)tfp+go；(ⅲ)tfp+go+dnasei；(ⅳ)tfp+go+target；(ⅴ)tfp+go+dnasei+target；(ⅵ)sfp1+go+dnasei+target；(ⅶ)sfp2+go+dnasei+target。50nm的第一探针、第二探针与ssdna三者分别在95℃水浴下变性5min，然后冰浴10min，最后将三者在室温下混合孵育30min，组装成两个fam荧光标记的双荧光标记探针(tfp)。采用上述相同的方法将50nmssdna分别与第一探针、第二探针组装成第一单荧光探针(sfp1)、第二单荧光标记探针(sfp2)。本申请实施例的反应体积均为100μl，所有物质浓度都为终浓度。各组溶液均用tris-hcl(ph7.4)定容至100μl，go浓度为0.09mg/ml，荧光探针sfp1、sfp2、tfp浓度为50nm，go分别和3种荧光探针室温孵化10min。靶标rna浓度40nm，1udnasei同时加入检测体系室温孵化50min，充分反应后在激发波长495nm，发射波长520nm下分别测定各组混合液的荧光强度。
不同条件下考察tfp/go的可行性，如图5所示。未加入go的tfp的荧光强度比其他强很多(曲线ⅰ)。然而当go加入体系后，荧光淬灭率达到95％以上，表明tfp全部吸附在go表面，由于fret荧光被淬灭(曲线ⅱ)。当dnasei加入到tfp/go中，荧光信号几乎不产生变化，表明go能够保护tfp而不被dnasei降解(曲线ⅲ)。当加入80nm的靶标，荧光信号恢复(曲线ⅳ)，表明tfp通过捕捉探针与靶标rna特异性结合，使得探针从石墨烯上脱离下来。当在检测体系中加入dnasei(曲线ⅴ)，检测到的荧光值远远高于曲线4，表明dnasei随机裂解了体系中自由存在的ssdna、dsdna，靶标被释放参与到下一个循环，产生更多自由fam。与曲线5相比，当第一探针(曲线ⅵ)与第二探针(曲线ⅶ)单独存在时，荧光值增加并不显著，表明两个fam标记的探针能大大的提高检测的荧光强度。基于以上结果，新构建的tfp/go体系检测金黄色葡萄球菌是可行的，不仅能成功的检测靶标而且能显著提高检测的灵敏度。
为探明tfp/go对16srrna靶标序列的检测能力，分别将7个不同浓度梯度(0.3、1、10、20、30、40、60nm)靶标序列rna与dnasei同时加入到tfp/go中，室温孵化50min后在激发波长495nm，发射波长520nm下分别测定各混合液的荧光强度。
为考察tfp/go的检测下限，我们分别对不同靶标rna浓度进行了荧光测定，结果如图6所示，根据图6的荧光曲线，得出靶标rna浓度与荧光值的关系，如图7所示。当rna浓度为1nm～60nm范围，荧光值与靶标rna浓度呈现较好的线性关系(y＝7.216x+93.52，r2＝0.998)，检测下限达0.3nm，灵敏度高，检测下限低。
为了评价tfp/go对在实际样品中金黄色葡萄球菌检测的灵敏度，准备不同浓度(50、102、103、104、105、106、107cfu/ml)的靶细菌菌液，冷冻离心(1700g)收集菌体，用总rna试剂盒提取总rna。然后将总rna和dnasei同时加入到tfp/go复合液，室温孵化50min，然后在激发波长495nm，发射波长520nm下分别测定混合液的荧光值。
为进一步证明tfp/go在菌体检测方面的特异性，选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌k88、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性弧菌、甲型副伤寒沙门氏菌。将这10种菌制备成相同浓度(105cfu/ml)菌。然后分别提取其菌液的总rna，分别将其和dnasei同时加入到tfp/go复合液，室温孵化50min后测定荧光值。
tfp/go对靶标rna的检测下限低并不意味着它在实际菌种检测性能好。因此我们使用tfp/go检测了不同浓度的金黄色葡萄球菌，结果如图8所示，根据图8的荧光曲线，得出金黄色葡萄球菌浓度与荧光值的关系，如图9所示。荧光强度随着浓度的增大而增大，且在102～107浓度范围内呈良好的直线关系(y＝83.28x-103.6，r2＝0.997)，检测下限低至50cfu/ml。
如图10所示，tfp/go检测10种相同浓度菌液时，金黄色葡萄球菌的荧光值远远高于空白对照组。非靶标菌的荧光值几乎接近于背景信号，因此tfp/go检测特异性很强，体现良好的临床应用前景。
由以上技术方案可知，本申请提供一种金黄色葡萄球菌检测方法，包括：将第一探针、第二探针及单链dna组建成带有两个羧基荧光素标记的双荧光标记探针；将所述双荧光标记探针与氧化石墨烯溶液混合形成复合液；提取待测菌液的总rna；将所述总rna和脱氧核糖核酸酶同时加入所述复合液中形成混合液，孵化所述混合液；测定孵化后的所述混合液的荧光值，根据所述荧光值计算金黄色葡萄球菌的浓度。本申请实施例以一段特异性识别的金黄色葡萄球菌16srrna为靶标设计探针，基于荧光叠加原理构建探针/氧化石墨烯体系，并利用脱氧核糖核酸酶的特性使靶标循环检测，放大荧光信号，提高金黄色葡萄球菌检测的灵敏度。传统的检测方法，一个靶标只能产生一个荧光分子，本申请实施例采用了双荧光分子标记法，使荧光强度增大，并通过dnasei降解dna的特性，靶标分子能循环被检测，产生多个荧光分子，从而大幅度的降低了金黄色葡萄球菌的检测下限。本申请实施例将靶标与dnasei同时加入，检测时一边识别靶标，一边进行酶切作用，大大提高检测效率，检测所需时间不到2h。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的申请后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。