磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法与流程

本发明涉及一种磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌种类的方法。

背景技术：

人体肠道中存在1000多种肠道菌，这些肠道菌构成了一个极其复杂的微生态系统。研究发现这个微生态系统与我们的身体健康存在密切关系。虽然近年来对于肠道微生态系统的研究得到了越来越多的重视，但是对于肠道菌表面抗原的研究还处于初始阶段，已知在肠道菌表面存在多种糖抗原和鞭毛蛋白等，研究发现这些肠道菌抗原与肠道菌定殖和肠道稳态有重要联系，因此研究这些肠道菌表面抗原就成为研究的热点，而对于含有这些抗原的肠道菌的筛选就成为了研究肠道菌表面抗原的基础工作，所以有必要将含特定抗原的肠道菌筛选出来，并鉴定其种类。

免疫磁珠技术是以高均一性的磁性微球为固相支持物，将免疫配基(如抗体,抗原等)功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下发生力学移动，从混合溶液中分离出特异性的靶物质。免疫磁珠技术目前多用于致病菌的分离，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单等优点。16srdna序列分析已成为细菌分类鉴定的重要方法，这种序列分析方法比传统方法有更高的检出率。因为肠道菌有很多种类是不可培养的，因此我们不能用传统的表型观察等手段来鉴定其种类，因此只能用16srdna测序来鉴定其种类。但检索发现利用磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌种类的方法还未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌种类的方法。

本发明是利用抗原抗体特异性结合和16srdna测序相结合的原理，将表面含有特定抗原的肠道菌特异性地结合在连接有相应抗体的磁珠上，从而在磁场力的作用下，将含有特定抗原的肠道菌从肠道菌群中分离出来，然后利用16srdna测序方法鉴定其种类。

本发明所述磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌种类的方法，包括肠道菌样品的处理和提取、含相应抗体磁珠的制备、利用磁珠分选表面含特定抗原的肠道菌、16srdna测序分析判定肠道菌的物种种类，其特征在于：

所述肠道菌样品的处理和提取方法是：称取粪便0.5g放置于15ml离心管中，加5mlpbs(磷酸盐缓冲溶液)，漩涡振荡10分钟；200～500rpm离心3分钟，把上清液转移到50ml离心管中，加10mlpbs后10000rpm离心10分钟；弃掉上清液，加2mlpbs悬浮菌体，再加10mlpbs后10000rpm离心10分钟，如此过程重复至离心后上清液无色；用1mlpbs悬浮菌体，每管加入4ml固定液，室温放置12个小时；每管加入20mlpbs，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，加入1ml6％封闭液悬浮菌体，再将其吸到1.5ml离心管中，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，再用0.6％封闭液洗涤菌体2次，然后用pbs稀释肠道菌，使其od600＝0.6；

所述含相应抗体磁珠的制备方法是：以常规方法或委托北京市科学器材公司将相应抗体连接到磁珠上；

所述利用磁珠分选表面含特定抗原的肠道菌：用pbs将含相应抗体的磁珠稀释至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul肠道菌溶液中，共放置于1.5ml离心管中并在混匀器上振荡混匀30分钟，然后快速离心去除溶液层；将含有磁珠的样品溶液放在磁力架装置上，静置30±10分钟至管内液体澄清，轻轻吸取上清液弃掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，则放回离心管中重新放置到磁力架装置上再进行分选；将弃掉上清液的离心管从磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重悬，再放在磁力架上静置30±10分钟至管内液体澄清，小心吸取上清液弃掉，如此重复以上步骤三次；最后向离心管中加入200ulpbs溶液，重悬，获得表面含特定抗原的肠道菌样品；

所述16srdna测序分析判定肠道菌的物种种类的方法是：对获得表面含特定抗原的肠道菌样品进行dna提取，检测合格的样品构建文库，用合格的文库进行cluster制备和16srdna测序；用下机得到的数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的cleandata方可用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在给定的相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；根据otu和物种注释结果进行样品物种复杂度和组成分析，给出肠道菌的物种种类的判定。

以上磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法中：所述相应抗体优选是a血型抗体或b血型抗体。

以上磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法中：磁珠的粒径为300nm。

以上磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法中：固定液为5％多聚甲醛。

以上磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法中：封闭液为牛血清白蛋白。

以上磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌的方法中：16srdna测序应用的是illumina平台检测的v4区序列。

本发明公开了一种磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含特定抗原肠道菌种类的方法，是采用抗原与抗体特异性结合和16srdna测序相结合的原理，通过包被有相应抗体的磁珠，特异性的结合肠道菌表面特定抗原，从而将含有特定抗原的肠道菌筛选出来，然后用16srdna测序的方法，对筛选到的肠道菌进行物种鉴定。本发明的优点是：本方法可以将肠道菌中所有带有特定抗原的肠道菌筛选鉴定出来，避免了常规表型分析方法中对不可培养细菌的检测遗漏；同时，本发明又具有快速、高效、准确度高的特点。本发明为筛选不同表面抗原的肠道菌提供了一个可行的方法，同时也为下一步精准的研究肠道菌奠定了基础。

附图说明

图1为利用本方法检测到含a血型抗原的肠道菌在门的组成情况。

图2为利用本方法检测到含b血型抗原的肠道菌在门的组成情况。

具体实施方式

实施例1:

磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含a血型抗原的肠道菌，具体步骤是：

肠道菌样品的处理和提取方法是：称取粪便0.5g放置于15ml离心管中，加5mlpbs(磷酸盐缓冲溶液)，漩涡振荡10分钟；200～500rpm离心3分钟，把上清液转移到50ml离心管中，加10mlpbs后10000rpm离心10分钟；弃掉上清液，加2mlpbs悬浮菌体，再加10mlpbs后10000rpm离心10分钟，如此过程重复至离心后上清液无色；用1mlpbs悬浮菌体，每管加入4ml固定液，室温放置12个小时；每管加入20mlpbs，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，加入1ml6％封闭液悬浮菌体，再将其吸到1.5ml离心管中，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，再用0.6％封闭液洗涤菌体2次，然后用pbs稀释肠道菌，使其od600＝0.6；

含a血型抗体磁珠的制备方法是：委托北京市科学器材公司将市售a血型抗体连接到磁珠上；

利用磁珠分选表面含a血型抗原的肠道菌：用pbs将含a血型抗体的磁珠稀释至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul肠道菌溶液中，共放置于1.5ml离心管中并在混匀器上振荡混匀30分钟，然后快速离心去除溶液层；将含有磁珠的样品溶液放在磁力架装置上，静置30±10分钟至管内液体澄清，轻轻吸取上清液弃掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，则放回离心管中重新放置到磁力架装置上再进行分选；将弃掉上清液的离心管从磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重悬，再放在磁力架上静置30±10分钟至管内液体澄清，小心吸取上清液弃掉，如此重复以上步骤三次；最后向离心管中加入200ulpbs溶液，重悬，获得表面含a血型抗原的肠道菌样品；

16srdna测序分析判定肠道菌的物种种类的方法是：对获得表面含a血型抗原的肠道菌样品进行dna提取，检测合格的样品构建文库，用合格的文库进行cluster制备和16srdna测序；用下机得到的数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的cleandata方可用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在给定的相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；根据otu和物种注释结果进行样品物种复杂度和组成分析，给出肠道菌的物种种类的判定。

结果分析：

含a血型抗原的肠道菌集中在五个门，拟杆菌门占28％，厚壁菌门占27％，梭杆菌门占1％，变形菌门占41％，放线菌门占3％，见图1。

实施例2:

磁珠法与测序相结合筛选并鉴定表面含b血型抗原的肠道菌，具体步骤是：

肠道菌样品的处理和提取方法是：称取粪便0.5g放置于15ml离心管中，加5mlpbs(磷酸盐缓冲溶液)，漩涡振荡10分钟；200～500rpm离心3分钟，把上清液转移到50ml离心管中，加10mlpbs后10000rpm离心10分钟；弃掉上清液，加2mlpbs悬浮菌体，再加10mlpbs后10000rpm离心10分钟，如此过程重复至离心后上清液无色；用1mlpbs悬浮菌体，每管加入4ml固定液，室温放置12个小时；每管加入20mlpbs，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，加入1ml6％封闭液悬浮菌体，再将其吸到1.5ml离心管中，7000rpm离心10分钟，倒掉上清，再用0.6％封闭液洗涤菌体2次，然后用pbs稀释肠道菌，使其od600＝0.6；

含b血型抗体磁珠的制备方法是：委托北京市科学器材公司将市售b血型抗体连接到磁珠上；

利用磁珠分选表面含b血型抗原的肠道菌：用pbs将含b血型抗体的磁珠稀释至1mg/ml，吸取100ul此磁珠溶液，加入到提取到的od600＝0.6的900ul肠道菌溶液中，共放置于1.5ml离心管中并在混匀器上振荡混匀30分钟，然后快速离心去除溶液层；将含有磁珠的样品溶液放在磁力架装置上，静置30±10分钟至管内液体澄清，轻轻吸取上清液弃掉，避免吸到磁珠，如吸取的上清中含有磁珠，则放回离心管中重新放置到磁力架装置上再进行分选；将弃掉上清液的离心管从磁力架上取出，加入1mlpbs溶液，重悬，再放在磁力架上静置30±10分钟至管内液体澄清，小心吸取上清液弃掉，如此重复以上步骤三次；最后向离心管中加入200ulpbs溶液，重悬，获得表面含b血型抗原的肠道菌样品；

16srdna测序分析判定肠道菌的物种种类的方法是：对获得表面含b血型抗原的肠道菌样品进行dna提取，检测合格的样品构建文库，用合格的文库进行cluster制备和16srdna测序；用下机得到的数据经过数据过滤，滤除低质量的reads，剩余高质量的cleandata方可用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成tags；在给定的相似度下将tags聚成otu，然后通过otu与数据库比对，对otu进行物种注释；根据otu和物种注释结果进行样品物种复杂度和组成分析，给出肠道菌的物种种类的判定。

结果分析：含b血型抗原的肠道菌集中在五个门，拟杆菌门占24％，厚壁菌门占52％，梭杆菌门占1％，变形菌门占20％，放线菌门占1％，见图2。