一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取DNA的方法与流程

本发明涉及植物dna制备技术领域，具体来说是一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取dna的方法。

背景技术：

核酸是构成生命体中基本遗传物质的主要化合物，从核酸分子水平系统深入的研究是认识各种生命现象的基础。植物dna的提取主要用于基因文库构建、pcr分析及southern杂交等，因此高质量的dna的获得对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。目前，在植物提取dna的研究中，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、初皮部等组织器官中提取出dna。这些方法多采用新鲜或冷冻的材料，但对于野外，尤其是远距离采样，携带冰壶或液氮非常不方便，这需要在提取dna前对样本作一些特殊的处理，有研究发现通过硅胶干燥后的片可用于植物基因组dna的提取，但是不论幼嫩的叶片或成熟的叶片，虽叶片迅速失水，但在植物叶片组织中还含有大量的多糖、多酚、蛋白和酯类等植物次生代谢产物及降解的dna，这使得提取dna的常出现产量低、质量差、易降解，影响了dna质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行pcr扩增，用新鲜叶片材料提取有着很大的差异。

生态建设、环境保护日益受到大家的关注，植物是重要的自然资源环境要素，对于维持生态平衡和发展经济有着重要作用，然而随着科技的发展,我们的生活日益提高.可是,我们的地球却受到了危害，森林资源遭受严重的破坏，许多珍贵的植物资源遭到毁灭性的打击，因此，植物dna的提取研究对植物的就地保护、种质资源收集保存及种源培育工作尤为重要。

目前，关于植物dna提取方法的报道绝大部分都是在sds法和ctab法基础上进行改良，但都无法摆脱用研磨棒或玻璃棒对样品逐个研磨的操作步骤，且提取步骤繁琐耗时,传统的ctab法是目前应用最广泛的dna提取方法，但是该方法在提取植物干燥叶片时，残留了大量的蛋白糖类物质，影响到后续的pcr扩增、遗传多态性分析研究,迄今，还未见针对植物干燥叶片中提取高质量dna的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中的提取复杂繁琐、无法提取高质量dna的缺陷，提供一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取dna的方法来解决上述问题。

本发明公开了一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取dna的方法，具体步骤为：

(1)、取20mg干燥海叶片组织加入到2.0ml冷冻研磨离心管中，并放入1个已灭菌钢珠，液氮冷冻3-5min，将离心管放入研磨仪中研磨8-12min，得到干粉；

(2)、将步骤(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，涡旋震荡1min，室温放置15min，期间上下颠倒5-10次；

(3)、向步骤(2)中产品加入130ul缓冲液lp2，涡旋震荡1min；

(4)、将步骤(3)中的离心管置于离心机中，12000rpm(～13400*g)离心5min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中；

(5)、向步骤(4)得到的上清液中加入1.5倍的缓冲液lp3，充分震荡混匀15-30sec；

(6)、将步骤(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一个吸附柱cb3中，将吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重新将吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重复此步骤一次；

(8)、将吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)离心3min，倒掉废液，将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，室温放置5-10min，彻底晾干吸附柱中的残余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中间部位悬空加入50ul无核酸酶水，室温放置5min，12000rpm(～13400*g)离心5min，取出并丢弃吸附柱；

(10)、对dna浓度及纯度检测，-20℃保存样本。

作为优选，所述的步骤(1)中，在将离心管放入研磨仪之前，需要对研磨仪先预冷；

作为优选，所述的步骤(1)中，在将干燥海叶片组织加入冷冻研磨离心管之前，先使用无菌水配置的80％乙醇进行冲洗，晾干后，将海叶片组织剪碎；

作为优选，所述的步骤(2)中，所述的rnase的浓度为10mg/ml；

作为优选，所述的步骤(4)中，在将上清液转移至新的1.5ml离心管的过程中，不要碰到沉淀；

作为优选，所述的步骤(9)中，在将无核酸酶水加入吸附膜中间部位时，需要先将无核酸酶水预热至65℃。

本发明相比现有技术具有以下优点：

根据本发明，在传统试剂盒与研磨法的基础上，灵活调整步骤，使干燥叶片快速高效的研磨成粉末抽提dna，能够从微量干燥叶片中提取高质量的基因组dna，提取比较便捷。

附图说明

图1是本发明的实施例与ctab法抽提dna的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是改良试剂盒法抽提dna，2ul稀释10倍稀释后dnapcr电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明公开了一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取dna的方法，具体步骤为：

(1)、取20mg干燥海叶片组织加入到2.0ml冷冻研磨离心管中，并放入1个已灭菌钢珠，液氮冷冻3-5min，将离心管放入研磨仪中研磨8-12min，得到干粉；

(2)、将步骤(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，涡旋震荡1min，室温放置15min，期间上下颠倒5-10次；

(3)、向步骤(2)中产品加入130ul缓冲液lp2，涡旋震荡1min；

(4)、将步骤(3)中的离心管置于离心机中，12000rpm(～13400*g)离心5min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中；

(5)、向步骤(4)得到的上清液中加入1.5倍的缓冲液lp3，充分震荡混匀15-30sec；

(6)、将步骤(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一个吸附柱cb3中，将吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重新将吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重复此步骤一次；

(8)、将吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)离心3min，倒掉废液，将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，室温放置5-10min，彻底晾干吸附柱中的残余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中间部位悬空加入50ul无核酸酶水，室温放置5min，12000rpm(～13400*g)离心5min，取出并丢弃吸附柱；

(10)、对dna浓度及纯度检测，-20℃保存样本。

作为优选，所述的步骤(1)中，在将离心管放入研磨仪之前，需要对研磨仪先预冷；

作为优选，所述的步骤(1)中，在将干燥海叶片组织加入冷冻研磨离心管之前，先使用无菌水配置的80％乙醇进行冲洗，晾干后，将海叶片组织剪碎；

作为优选，所述的步骤(2)中，所述的rnase的浓度为10mg/ml；

作为优选，所述的步骤(4)中，在将上清液转移至新的1.5ml离心管的过程中，不要碰到沉淀；

作为优选，所述的步骤(9)中，在将无核酸酶水加入吸附膜中间部位时，需要先将无核酸酶水预热至65℃。

实施例1

本发明公开了一种改良试剂盒法从微量干燥叶片中提取dna的方法，具体步骤为：

(1)、取同种植物的不同生长时期干燥海叶片组织20mg，使用无菌水配置的80％乙醇进行冲洗，并将晾干叶片剪碎并转移至2.0ml冷冻研磨离心管中，并放入1个已灭菌钢珠，液氮冷冻4min，并将离心管放入液氮预冷研磨仪中研磨10min，得到干粉；

(2)、将步骤(1)得到的干粉加入500ullp1和6ulrnase，涡旋震荡1min，室温放置15min，期间上下颠倒7次；

(3)、向步骤(2)中产品加入130ul缓冲液lp2，涡旋震荡1min；

(4)、将步骤(3)中的离心管置于离心机中，12000rpm(～13400*g)离心5min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中；

(5)、向步骤(4)得到的上清液中加入1.5倍的缓冲液lp3，充分震荡混匀20sec；

(6)、将步骤(5)得到的溶液及沉淀全部加入同一个吸附柱cb3中，将吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重新将吸附柱cb3放回收集管中；

(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)离心30sec，倒掉废液，重复此步骤一次；

(8)、将吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)离心3min，倒掉废液，将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，室温放置7min，彻底晾干吸附柱中的残余漂洗液，得到吸附膜；

(9)、向吸附膜中间部位悬空加入50ul无核酸酶水，室温放置5min，12000rpm(～13400*g)离心5min，取出并丢弃吸附柱；

(10)、对dna浓度及纯度检测，-20℃保存样本。

作为优选，所述的步骤(1)中，在将离心管放入研磨仪之前，需要对研磨仪先预冷；

作为优选，所述的步骤(2)中，所述的rnase的浓度为10mg/ml；

作为优选，所述的步骤(4)中，在将上清液转移至新的1.5ml离心管的过程中，不要碰到沉淀；

作为优选，所述的步骤(9)中，在将无核酸酶水加入吸附膜中间部位时，需要先将无核酸酶水预热至65℃。

采用nanodrop测定提取dna的浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测提取dna的完整性，经测定样本的a260/a280在1.8左右，从nanodrop和琼脂糖电泳可以看出，对比采用传统的ctab法提取干燥叶片dna，尽管可获得dna，但dna的纯度和浓度均很低，质量很差，相对的，采用实施例的方法可在相同样品量的前提下，提取获得纯度和浓度高，完整性好的基因组dna，在后续的pcr作为模板进行高效扩增，尤其适用于比较稀缺珍贵的样本。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。