一种人结直肠癌蛋白质标志物CLCA1试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种用于人结直肠癌标志物试剂盒，尤其涉及一种用于人结直肠癌标志物clca1试剂盒，是一种蛋白质钙离子激活氯离子通道蛋白1(calcium-activatedchloridechannel1,clca1)，以及该试剂盒的应用。

背景技术：

根据世界卫生组织最新的统计数据，在全球范围内，结直肠癌的发病率居所有恶性肿瘤的第三位，死亡率居第四位。结直肠癌早期症状不明显，且目前为止，没有一种特异性和敏感性均较好的标志物用于早期检测结直肠癌，一半以上的患者确诊时已处于局部晚期或晚期。临床分期是决定结直肠癌患者预后的一个及其重要的因素，早期患者的5年生存率可达到90％，而晚期患者的5年生存率不到10％。因此，尽早诊断结直肠癌对于提高结直肠癌患者的生存率和疗效具有非常重大的意义。

其次，对于治疗后病人的预后、生存期的预测，常规方法依赖于病理参数、tnm分期等因子,但病理判断受人为因素干扰较大,且预测特异性不高，非常需要有差异显著、灵敏度高、特异性好、操作方便的分子标志物来作为辅助判断方法。

因此，寻找结直肠癌的有效标志物,早期诊断及预测生存成为广大医学工作者的迫切任务。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种人结直肠癌蛋白质标志物clca1试剂盒，该试剂盒包括针对clca1的特异性抗体、edta抗原修复液、内源性过氧化物酶阻断剂、山羊血清、二抗、pbs缓冲液、苏木素、分化液、dab显色液，

作为优选，内源性过氧化物酶阻断剂为3％过氧化氢；

pbs缓冲液配置方法：称取nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，加蒸馏水至1000ml，充分混匀，调节ph到7.2-7.6；

edta抗原修复液配方：称取tris30.27g，edta(乙二胺四乙酸)1.461g，加蒸馏水至500ml，充分混匀，使用前稀释10倍；

苏木素配置方法：称取苏木精2g，溶于250ml无水乙醇中；称取硫酸铝17.6g，溶于750ml蒸馏水中；将溶解后的苏木精和硫酸铝混匀，用玻璃棒搅拌，边搅拌边加入碘酸钠0.25g，放于自动搅拌机上搅拌过夜；第二日加入20ml冰醋酸；

分化液配置方法：取浓盐酸1ml,加入无水乙醇99ml，配成1％盐酸酒精分化液；

dab显色液配置方法：1ml蒸馏水中，加入dab缓冲液(20×)，dab底物(20×)及dab色原(20×)各50μl，混匀，使用前配置。

本发明的另一个目的是提供一种人结直肠癌蛋白质标志物clca1试剂盒的应用，所述应用是指作为筛选抗结直肠癌药物靶标；是用于制备筛查、诊断或预测人结直肠癌的制剂；或用于制备缓解或治疗人结直肠癌的药物。

根据本发明的研究结果，免疫组织化学、westernblot、酶联免疫吸附试验表明，clca1在正常结直肠组织中的表达量显著高于结直肠癌组织，且clca1在健康人血液中的含量显著高于结直肠癌患者血液中的含量。而且，clca1高表达的结直肠癌患者生存期显著长于clca1低表达的患者。因此,clca1可以作为一种新的人结直肠癌蛋白质标志物，并可用于筛选抗结直肠癌药物的靶标，为有效判断结直肠癌癌变进程提供科学依据，为早期检测结直肠癌及判定预后提供科学依据。

本发明提供的一种人结直肠癌蛋白质标志物clca1试剂盒的检测方法，通过以下步骤实现：(1)制备石蜡切片；(2)检测石蜡切片中clca1的表达量。石蜡切片为离体的人源组织制成。利用clca1抗体与样本中的蛋白反应，检测clca1的表达量。例如，在本发明的一个优选实施例中，采用免疫组织化学技术确定样本中clca1的存在及表达量。

本发明提供了一个用于区分人结直肠癌组织以及癌旁正常组织的蛋白质标志物clca1试剂盒,该试剂盒利用该标志物制备早期诊断人结直肠癌、判断预后。本发明为有效判断人结直肠癌癌变进程提供科学依据。本发明的检测试剂盒高效、方便、成本较低。

附图说明

图1是利用免疫组织化学染色的方法分析人结直肠癌组织及癌旁正常组织中clca1的表达量。对18对结直肠癌组织及其癌旁组织免疫组化分析发现，clca1在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.0001)，clca1在94.4％(17/18)的癌旁组织中呈阳性表达，而仅在11.1％(2/18)的结直肠癌组织中呈阳性表达。图1a及1c为clca1在结直肠癌中表达阴性的代表性图，分别放大100倍及400倍，图1b及1d为clca1在癌旁组织中表达阳性的代表性图，分别放大100倍及400倍，图中“肿瘤”代表结直肠癌组织，“正常”代表癌旁正常组织。

图2是clca1在结直肠癌组织及其癌旁组织中的westernblot典型条带图,t代表结直肠癌组织，n代表癌旁正常组织。

图3是19对结直肠癌组织及其癌旁组织westernblot条带灰度分析结果，以gapdh为内参照，clca1在结直肠癌组织中平均灰度值为0.40±0.48，而在癌旁正常组织中平均灰度值为1.08±0.47，t检验表明，差异具有统计学意义，p<0.0001。

图4是酶联免疫吸附法测定clca1在结直肠癌患者及健康对照者血液中含量的散点图。对100例结直肠癌患者及76例健康对照者血液中clca1含量的分析发现，clca1在结直肠癌患者血液中的平均浓度为1.48±1.06ng/ml，显著低于健康对照组血液中的平均浓度1.06±0.73ng/ml(p＝0.0018)。

图5是kaplan-meier方法分析clca1的基因表达与结直肠癌患者生存的关系图。clca1基因低表达组的平均生存时间为64.9个月(n＝22,标准误9.8，95％置信区间为45.7-84.1)，而clca1基因高表达组的平均生存时间为90.7个月(n＝24,标准误6.5，95％置信区间为77.9-103.4)，logrank检验表明两组差异具有统计学意义(p＝0.034),说明clca1基因为结直肠癌有效的预后因子。图中0表示低表达组(clca1基因表达值<100)，1表示高表达组(clca1基因表达值≥100)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明,而不会限制本发明。

实施例1clca1免疫组化检测试剂盒的制备

该试剂盒包括针对clca1的特异性抗体、edta抗原修复液、内源性过氧化物酶阻断剂、山羊血清、二抗、pbs缓冲液、苏木素、分化液、dab显色液，

其中内源性过氧化物酶阻断剂为3％过氧化氢；

pbs缓冲液配置方法：称取nacl8.0g，kcl0.2g，na2hpo41.44g，kh2po40.24g，加蒸馏水至1000ml，充分混匀，调节ph到7.2-7.6；

edta抗原修复液配方：称取tris30.27g，edta(乙二胺四乙酸)1.461g，加蒸馏水至500ml，充分混匀，使用前稀释10倍；

苏木素配置方法：称取苏木精2g，溶于250ml无水乙醇中；称取硫酸铝17.6g，溶于750ml蒸馏水中；将溶解后的苏木精和硫酸铝混匀，用玻璃棒搅拌，边搅拌边加入碘酸钠0.25g，放于自动搅拌机上搅拌过夜；第二日加入20ml冰醋酸；

分化液配置方法：取浓盐酸1ml,加入无水乙醇99ml，配成1％盐酸酒精分化液；

dab显色液配置方法：1ml蒸馏水中，加入dab缓冲液(20×)，dab底物(20×)及dab色原(20×)各50μl，混匀，使用前配置。

实施例2用制备的试剂盒对待测样本进行检测

操作流程如下：

1.石蜡切片：取病理确诊为结直肠癌的手术标本及其癌旁正常组织，经福尔马林固定，石蜡包埋后制成石蜡块，切片厚度为5微米，所有患者术前均未接受抗肿瘤治疗。

2.烤片：将石蜡切片放入60摄氏度恒温箱中，烤片2小时。

3.脱蜡和水化：

1)将石蜡切片依次放入两缸二甲苯中，脱蜡两次，每次20分钟；

2)水化：将石蜡切片依次放入两缸无水乙醇中，每缸5分钟；取出石蜡切片，依次放入两缸95％乙醇中，每缸5分钟；取出石蜡切片，放入90％乙醇中，5分钟；取出石蜡切片，放入75％乙醇中，5分钟；

3)取出石蜡切片，用蒸馏水冲洗5分钟。

4.抗原修复：

1)将处理好的切片置于切片架,放入含有1000毫升edta抗原修复液的烧杯中,电炉加热至沸腾,用小火继续煮沸15分钟；

2)将烧杯拿离火源，自然冷却至室温，将石蜡切片放入蒸馏水中洗两次，每次3分钟，换pbs液洗3分钟。

5.阻断内源性过氧化物酶：

1)每张切片滴加一滴内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育30分钟；

2)将切片用pbs洗3次，每次3分钟。

6.封闭：每张切片滴加一滴山羊血清，室温孵育30分钟，倾去血清。

7.加入一抗：

1)每张切片滴加50微升稀释1000倍的clca1特异性抗体(购自abcam公司,ab180851)，放入湿盒中，4摄氏度过夜；

2)将切片用pbs洗3次，每次5分钟。

8.加入二抗：

1)除去pbs液，每张切片滴加50微升envision^tm+/hrp兔工作液(购自迈新公司)，室温孵育30分钟；

2)将切片用pbs洗3次，每次5分钟。

9.dab显色：配置dab稀释液，每张切片滴加100微升dab稀释液，显微镜下观察2-5分钟，显色后用自来水冲洗15分钟。

10.苏木素复染：将切片放入苏木素中染色10分钟，自来水冲洗5分钟；盐酸酒精分化2秒钟，自来水冲洗5分钟。

11.脱水及封片：

1)将切片放入75％乙醇中，脱水5分钟；取出切片，放入95％乙醇中，5分钟；取出切片，依次放入两缸无水乙醇中，每次5分钟；

2)中性树胶封片，通风橱中晾干。

实施例3试剂盒的临床验证

用上述实施例1制备的试剂盒,依据实施例2的检测步骤与方法，检测了18对结直肠癌组织及其癌旁组织clca1的表达情况。所有组织标本在手术后经浙江大学医学院附属第二医院病理科进行病理证实。每张切片随机选取至少10个高倍镜视野(×200),至少计数1000个细胞,以积分法计算结果。即根据每张切片的染色强度和阳性细胞比率进行联合计分。染色强度:无色0分；浅黄色1分；棕黄色2分；棕色3分。阳性细胞比率：<5％为0分；5％-10％为1分；11％-50％为2分；>50％为3分。取染色强度和阳性细胞比率的两种评分之和的平均值,<2分者为阴性,≥2分者为阳性。数据统计采用spss20.0软件进行。

分析结果表明，在18对结直肠癌组织及其癌旁组织中，clca1在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.0001)，clca1在94.4％(17/18)的癌旁组织中呈阳性表达，而仅在11.1％(2/18)的结直肠癌组织中呈阳性表达。clca1在结直肠癌中表达阴性的代表性图见图1a及1c，clca1在癌旁组织中表达阳性的代表性图见图1b及1d。上述临床验证的结果进一步表明，clca1可以作为结直肠癌诊断的分子标志物，采用本发明提供的试剂盒,检测人体结直肠组织clca1的表达水平,可以方便快捷地为结直肠癌诊断提供帮助。

实施例4用westernblot方法分析clca1在结直肠癌组织与癌旁正常组织中的含量。

操作流程如下：

1.蛋白质抽提：取病理确诊的结直肠癌新鲜冰冻组织及其癌旁正常组织，加入液氮研磨，研磨好的粉末倒入组织裂解液中，冰上裂解30分钟，12000rpm，4摄氏度离心10分钟，取上清即为组织细胞总蛋白，bca法测定蛋白浓度，已测浓度的蛋白样品按体积比4：1加入5×sds上样缓冲液，沸水中煮沸5分钟，-20摄氏度保存。

2.sds-page凝胶电泳：

1)制胶：将成套的灌胶玻璃板用夹子固定在底座上，配制10％分离胶，混匀后立即灌胶，上层用异丙醇封胶，室温聚合40分钟以上；待分离胶聚合后吸净上层的异丙醇，配制5％浓缩胶，混匀后立即灌胶，并插入梳子；

2)上样及电泳：待胶完全凝固后拔出梳子，将凝胶板转入电泳槽中，加入电泳缓冲液，取已变性的蛋白样品，每孔加40微克，同时加预染蛋白marker，作为分子量对照；盖上槽盖，接通电源，浓缩胶先以50v电压进行电泳,待溴酚蓝指示剂进入分离胶后转换成100v继续电泳,待指示剂跑至分离胶底部0.5cm左右停止电泳。

3.转膜：

1)在电泳即将结束前，将pvdf膜浸泡在甲醇中活化1分钟，然后将pvdf膜和滤纸浸泡在转膜缓冲液中15分钟；

2)撬开玻璃板，取出sds-page凝胶，按黑板-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫-白板的顺序将凝胶与pvdf膜固定于转膜夹内,整个操作在转膜缓冲液中进行，避免产生气泡；

3)将转膜夹放入电转仪中，接上电源，4摄氏度环境中250ma恒流转膜2.5小时。

4.封闭：转膜结束后取出pvdf膜，放入5％脱脂牛奶中，室温封闭1小时。

5.孵育一抗：一抗稀释1000倍，4摄氏度摇床孵育过夜。

6.孵育二抗：取出pvdf膜，tbst液洗涤3次，每次5分钟，二抗稀释5000倍，室温孵育2小时。

7.ecl试剂发光，显影和定影：取出pvdf膜，tbst液洗涤3次，每次5分钟，将ecl底物滴加到膜上，室温反应3min，放入暗盒中，用保鲜膜包好pvdf膜，暗室中用柯达x胶片感光，显影液中显影，定影液中定影。

8.结果：用imagej软件对条带进行灰度测量，gapdh为内参。对19对结直肠癌组织及其癌旁组织westernblot条带灰度分析发现，clca1在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.0001)。图2是clca1在结直肠癌组织及其癌旁组织中的westernblot典型条带图,t代表结直肠癌组织，n代表癌旁正常组织。图3是19对结直肠癌组织及其癌旁组织westernblot条带灰度分析结果，以gapdh为内参照，clca1在结直肠癌组织中平均灰度值为0.40±0.48，而在癌旁正常组织中平均灰度值为1.08±0.47，t检验表明，差异具有统计学意义，p<0.0001。

实施例5酶联免疫吸附试验检测clca1在结直肠癌患者与健康人血液中的含量

操作流程如下：

1.试剂盒：酶联免疫吸附试验检测clca1试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司(seg699hu)，组成：96孔板(预包被)、标准品(10ng/ml)、标准品稀释液、检测溶液a、检测溶液b、检测稀释液a、检测稀释液b、样本稀释液、浓洗涤液(30×)、tmb底物、终止液、覆膜。

2.实验步骤：

1)使用前试剂盒内所有试剂缓慢平衡至室温，避免快速溶解造成蛋白降解。

2)试剂配制：(1)标准品稀释液：将标准品高速离心后加入1ml样本稀释液溶解，充分混匀，其浓度为20ng/ml(贮液)，将其稀释为标准品s7(10ng/ml)。(2)取7个1.5ml离心管(s0-s6)依次排列，用于标准品稀释，在每个离心管中加入500μl标准品稀释液，吸取500μl标准品s7到第一个离心管中(s6)，轻轻吹打混匀，从s6中吸取500μl到第二个离心管(s5)中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释，s0仅为样本稀释液。s7-s0标准品浓度分别为10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.312ng/ml、0.156ng/ml、0ng/ml。(3)洗涤工作液：浓洗涤液按1:30倍用去离子水稀释，充分搅拌混匀,于临用前配妥。(4)检测溶液a及检测溶液b：检测溶液a及检测溶液b在使用前，分别以检测溶液a或b1:100倍分别用检测稀释液a或b进行稀释，轻轻混匀，临用前10分钟配妥。(5)底物溶液：请用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的tmb至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回tmb瓶中。

3)加样：设置标准品孔、待测样本孔，每孔分别加标准品或待测样本(血清)100μl，轻轻晃动混匀，覆上覆膜，37℃温育1小时。

4)弃去液体，甩干，不用洗涤。

5)每孔加检测溶液a工作液100μl(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

6)弃去孔内液体，甩干，每孔加350μl洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标仪朝下用力拍几次(也可轻拍讲孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。

7)每孔加检测溶液b工作液(临用前配制)100μl，覆上覆膜，37℃温育30分钟。

8)弃去孔内液体，甩干，洗板5次。方法同步骤7。

9)每孔加底物溶液(90μl/孔)，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在15～25分钟，不要超过30分钟，当标准品前3-4孔出现明显梯度蓝色，最后3孔显色不明显时即可加入终止)。

10)每孔加底物溶液(50μl/孔)，终止反应，此时蓝色立转黄色，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液加入顺序相同。如出现颜色不均一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

11)在确保酶标板无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标板在450nm波长依序测量各孔的光密度(od值)。

12)根据标准品吸光值及对应浓度计算标准曲线，根据标准曲线计算公式计算各孔待测样品浓度，乘以稀释倍数后得出血清中目标蛋白的浓度。

3.结果：对100例结直肠癌患者及76例健康人血液中clca1含量的分析发现，clca1在结直肠癌患者血液中的平均浓度为1.48±1.06ng/ml，显著低于健康人血液中的平均浓度1.06±0.73ng/ml(p＝0.0018)。图4是酶联免疫吸附法测定clca1在结直肠癌患者及健康人血液中含量的散点图。

实施例6kaplan-meier方法分析clca1的基因表达与结直肠癌患者预后的关系

提取46例结直肠癌组织总rna，进行基因芯片分析(affymetrixu133plus2.0)，检测clca1基因表达值。所有患者均具有随访数据。测出表达值后将患者按clca1基因表达水分为两组，表达值<100为低表达，用0表示；表达值≥100为高表达，用1表示。采用kaplan-meier方法分析结直肠癌患者的生存时间，logrank检验法比较两组的平均生存时间。结果表明，clca1基因低表达组的平均生存时间为64.9个月(n＝22,标准误9.8，95％置信区间为45.7-84.1)，而clca1基因高表达组的平均生存时间为90.7个月(n＝24,标准误6.5，95％置信区间为77.9-103.4)，两组差异具有统计学意义(p＝0.034),说明clca1基因为结直肠癌有效的预后因子。图5是kaplan-meier方法分析clca1的基因表达与结直肠癌患者预后的关系图，0表示低表达组，1表示高表达组。