一种橡胶树HbAG基因及其应用的制作方法

本发明生物技术领域，涉及一种橡胶树hbag基因及其应用。

背景技术：

巴西橡胶树俗称橡胶树，是中国热带地区重要的经济作物，其生产的天然橡胶是关系到国计民生的战略资源。随着国内天然橡胶消费量的逐年增加，受种植条件和宜胶地的限制，提高橡胶树单位面积产量迫在眉睫。橡胶树属多年生乔木，有性世代周期长，在橡胶树新品种选育中存在花多果少，座果率偏低等问题，导致许多杂交组合不能成功组配，使得橡胶树选育种效率受到很大限制，成为橡胶树育种中亟待解决的问题之一。因此，深入研究橡胶树花发育及生殖发育机理，旨在改变橡胶树“繁花少实”的现象，提高其坐果率，可为橡胶树优良杂交组合的配置提供理论基础与技术手段。

在植物花器官及生殖发育中，agamous基因作为一类重要的转录因子基因家族，它们在植物的生长发育和信号转导中起着关键性的调控作用，可以激活或抑制目的基因的转录表达，在植物生长发育和信号转导中起着重要的、不可或缺的作用。如前人研究表明agamous基因主要参与调控开花时间、决定花器官的发育、影响果实的成熟、调节营养器官的发育、以及对外界信号的响应。

技术实现要素：

本发明通过对不同发育时期的橡胶树花器官进行转录组测序分析，结合race试验和pcr分析，鉴定出一个橡胶树花器官特征因子agamous(ag)基因，进一步对这个花器官特征因子hbag基因进行生物信息学分析、进化树分析、时空表达模式分析、亚细胞定位、以及转基因功能验证，显示hbag的过表达可导致植株矮小，使得营养生长期缩短，从而促进植株提前开花。

本发明的第一个方面是提供一种橡胶树hbag基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明的第二个方面是提供一种蛋白质，其为本发明第一个方面所述的橡胶树hbag基因编码的蛋白质，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树hbag基因的克隆方法，包括以下步骤：(1)从橡胶树根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和/或雌花组织中提取总rna；(2)以总rna为模板进行反转录获得cdna；(3)设计hbag基因全长序列扩增引物对，进行pcr扩增，回收pcr产物，其中，hbag基因全长序列扩增引物对的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示；(4)pcr产物连接载体，转化，测序，获得hbag基因基因片段。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树hbag基因在促进植株提前开花中的应用。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树hbag基因在培育提前开花植株中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种表达载体，其含有本发明第一个方面所述的橡胶树hbag基因。

本发明的第七个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。该引物对可用于hbag基因全长序列扩增。

本发明首次从橡胶树中克隆得到hbag基因，该基因属于ag亚家族，参与花的发育、胚珠的形成和种子的成熟，执行d类基因功能。通过亚细胞定位分析表明该基因定位于细胞核，符合转录因子的特征。进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株出现开花时间明显提前，营养生长时间短，以及植株矮化等表型，表明该基因在橡胶树的花器官发育、以及生殖发育中起着重要的调控作用。将来利用hbag基因对橡胶树进行遗传改良，可为缩短橡胶树育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

附图说明

图1为橡胶树hbag基因的orf扩增电泳图。

图2为橡胶树mads-box基因外显子-内含子结构，其中，cdsf片段是第一个外显子，cdsi片段是中间的外显子，cdsl片段是最后一个外显子，刻度尺表示基因的长度，单位bp。

图3为橡胶树mads-box基因的相对荧光定量表达分析结果，其中，ro代表根、st代表茎、stt代表茎尖、le代表叶片、ba代表树皮、xy代表木质部、la代表胶乳、fr代表果实、hx3代表3cm花序、hx6代表6cm花序、hx9代表9cm花序、hx12代表12cm花序、xr代表雄蕊、cr代表雌蕊。

图4为植物过表达载体的构建和鉴定结果，其中，a：m:dl5000dnamarker，1:19t-hbag质粒经xhoi和psti双酶切，2:pxcs-hastrep质粒经xhoi和psti双酶切，3:pxcs-hastrep质粒无酶切对照；b:m:dl5000dnamarker，1:pxcs-hbag-hastrep质粒经xhoi和psti双酶切。

图5为转基因拟南芥阳性植株的pcr鉴定结果，其中，a:hbag基因；b：bar基因；ck：阴性对照。

图6为hbag的转基因植株的表型。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)或酵母遗传法实验指南(methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual，adamsaetal编，coldspringharborlaboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、橡胶树hbag基因的克隆

(1)取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和雌花等组织参照invitrogenreagent提取rna的方法步骤进行，得到符合后续试验要求的总rna。反转录，得到cdna。设计orf引物，以获得的cdna作为模板，进行pcr扩增，扩增条件如下：

a.设计引物如下：

forwardprimer(5’-3’)：atggcataccagagcgag；

reverseprimer(5’-3’)：ttaaactaactgaagggacatctg

b.pcr扩增体系如下：

c.反应程序为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分，34个循环；72℃延伸10分钟。pcr产物低温保藏备用。

(2)将pcr扩增产物加入5μl6×loadingbuffer混匀后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，得到的目的条带大小与预期一致。

用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收pcr产物，将回收的pcr产物与t载体连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取转化阳性的克隆提取质粒送测序，经过测序确定正确的克隆用于后续克隆及酶切。测序结果与之前的转录组里的序列大部分相同。

2、橡胶树hbag基因生物信息学分析

将得到的橡胶树hbag基因编码序列与橡胶树基因组序列比对，用以筛选相应的基因组序列信息，用fgenesh网站做hbag基因结构分析(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fgenesh&group＝programs&subgroup＝gfind)，进而得到hbag基因的内含子与外显子的数目及位置，基因结构分析结果显示橡胶树hbag基因包含7个外显子，6个内含子(图2)。

3、橡胶树不同组织中hbag基因表达分析

选取橡胶树的根、茎、茎尖、叶片、木质部、乳胶、果实、花序、雄花和雌花10个组织，花序又分成几个时期(以花序长度区分)，以橡胶树18s为内参基因，探究hbag基因在橡胶树各个组织器官中的表达情况。荧光定量分析结果表明hbag基因主要在橡胶树的茎尖、果实、花序、以及雄花和雌花中特异性高调表达(图3)，表明hbag基因参与了橡胶树花器官与生殖发育进程。

4、hbag基因过表达载体构建

用xhoi和psti两个限制性内切酶将含有酶切位点的19t-hbag基因载体和pxcs-hastrep载体切开(图4-a)，并回收载体大片段和目的基因片段，连接，然后转化dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提质粒，进行双酶切(图4-b)，得到两条酶切片段大约750bp和大于5000bp，片段大小符合预期，说明载体构建成功，正确载体命名为pxcs-hbag-hastrep。

5、转基因拟南芥植株的筛选

将构建好的表达载体pxcs-hbag-hastrep转入农杆菌。用沾花浸染(floraldipping)的方法转化拟南芥野生型。将转化后得到的t0代拟南芥种子放在含有20mg/lbasta的ms固体培养基上培养，培养两周后，转基因苗仍为绿色，不含目的载体的植株逐渐白化死去。待植株长到六片真叶时，移出存活的植株(如图5)。洗去根上的培养基，种植到营养土中。共转移出8株，标记为l1-8。取每株的一两片叶粗提dna，进行pcr验证。之后保留阳性植株，待种子成熟后，分株收种，得到t1代种子。然后再进行筛选，将t1代拟南芥种子放在含有30mg/lbasta的ms固体培养基上培养，将后代分离比为3:1的存活的植株随机选取8株，移栽到营养土中，待种子成熟后，分株收种，得到t2代种子。再次进行筛选，选用不发生性状分离的株系做后续实验。

以t0代8个株系的dna为模板，分别用bra基因引物和hbag基因引物进行pcr扩增。结果如图5所示，l1-l6株系都能扩增从400bp左右(bar)和750bp左右(hbag)的目的片段，说明这几个株系都是阳性植株。

6、转基因拟南芥植株的表型

选取后代存活分离比为3:1的两个株系l1和l5得到的纯合转基因种子和野生型的拟南芥种子，同时播种，在同样的培养条件，统计它们的形态学指标。分别统计植株的莲座叶数目、莲座上的最长叶片的长度、抽薹两周后的株高、以及从种子萌发到开花的时间和果荚成熟时的长度。结果如表1和图6所示。

表1hbag的转基因植株表型的统计分析

由表1可知：野生型植株的这些形态学指标都显著性的高于转基因株系的，说明野生型植株营养生长时间长，植株高大粗壮，而转基因植株开花时间明显提前，营养生长时间短，故植株矮小。

从图6可以直观看出它们的差异，转基因植株已经长出果荚了，野生型的才开始开花；转基因植株叶片整体偏小。通过局部的观察(图6)，可以看出野生型的莲座不仅叶片数目多，而且还长出了多个分枝，转基因植株没有明显的分枝或有分枝但是不长大，受到抑制作用；野生型的花序比较密集，开花比较多，茎上的分枝较多，转基因植株的每个小花比较分散，而且数目少，分枝也少。

进一步对转基因拟南芥中花发育相关内源基因的表达情况进行检测，结果显示在转基因拟南芥植株中hbag的过表达可以促进atft、atap1、atlfy和atful基因的表达，抑制atsvp基因的表达，推测hbag可能通过与这些基因的互作来影响橡胶树的生殖发育进程。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

sequencelisting

<110>中国热带农业科学院橡胶研究所

<120>一种橡胶树hbag基因及其应用

<130>123456

<160>4

<170>patentinversion3.3

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<223>hbag基因

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aacggtctgctcaagaaagcttatgaattatctgttctttgtgatgctgaggttgctctt180

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