本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备活性多糖的方法及其专用培养基和专用复合菌剂。
背景技术：
我国是农业大国，小麦是我国的主要粮食作物之一。小麦麸皮的年产量约为2000万吨，为面粉厂的加工副产品，多直接用于饲料工业；但由于麸皮中含有大量的粗纤维，蛋白质含量不高且质量较差，氨基酸含量也不能满足猪、鸡的营养需要，故常替代部分能量饲料或作为添加剂预混料的载体，其经济价值并未充分利用，造成了资源的极大浪费。
养殖业发展迅猛，但大规模和高密度的养殖使环境日益恶化，导致养殖动物自身免疫力下降，疾病频发。人们通过在饲料中添加低于治疗量的抗生素，以预防疾病、促进生长或提高动物的生产效率，但是随着研究的深入，已经认识到长期使用抗生素引发的问题和后果，因此，寻求抗生素的替代品已成为养殖业可持续发展的一个重要因素。自20世纪60年代以来，活性多糖作为一种免疫增强剂已广泛应用于临床医学，近年来又成功的应用于鱼虾等水产动物的病害防治中，且表现出显著的免疫增强效果。在畜牧行业，活性多糖也是一种具有发展前景的饲料添加剂和具有抗生素兼益生素双重作用的免疫促进剂，越来越受到学术界和养殖业的重视。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何利用小麦麸皮等制备活性多糖。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备活性多糖的方法。
本发明所提供的制备活性多糖的方法，依次可包括如下步骤：
(1)将复合菌剂、发酵原料和水混合，得到发酵体系；发酵，得到发酵产物；
(2)进行水提；
(3)进行醇沉，得到活性多糖；
所述复合菌剂含有枯草芽孢杆菌和酿酒酵母；
所述发酵原料包括78-82质量份的麸皮、8-10质量份的豆粕粉、9-12质量份的玉米粉和0.15-0.25质量份的尿素。
上述方法中，所述麸皮的制备方法具体可为：取无霉变的麸皮，过20目筛，留取的筛上麸皮。
上述方法中，所述豆粕粉的制备方法具体可为：取豆粕，粉碎，过40目筛，留取的筛下豆粕粉。
上述方法中，所述玉米粉的制备方法具体可为：将干玉米粉碎，过40目筛，留取筛下玉米粉。
上述方法中，所述复合菌剂具体可由枯草芽孢杆菌和酿酒酵母组成。
上述方法中，所述发酵原料可由78-82质量份的麸皮、8-10质量份的豆粕粉、9-12质量份的玉米粉和0.15-0.25质量份的尿素组成。
上述方法中，所述发酵原料具体可由78质量份的麸皮、10质量份的豆粕粉、12质量份的玉米粉和0.15质量份的尿素组成。
上述方法中，所述发酵原料具体可由80质量份的麸皮、10质量份的豆粕粉、10质量份的玉米粉和0.15质量份的尿素组成。
上述方法中，所述发酵原料具体可由82质量份的麸皮、8质量份的豆粕粉、9质量份的玉米粉和0.25质量份的尿素组成。
所述步骤(1)中，所述发酵体系中，复合菌剂的活性成分含量为2.00×107cfu/g-6.00×107cfu/g(如4.00×107cfu/g-6.00×107cfu/g、2.00×107cfu/g-4.00×107cfu/g、2.00×107cfu/g、4.00×107cfu/g或6.00×107cfu/g)。所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母的菌落形成单位比为1：(2-2.2)(如1：2、1：2.1或1：2.2)。所述发酵原料和所述水的质量比为1：(1-1.15)(如1：1或1：1.15)。所述发酵的温度为35℃-36℃(如35℃或36℃)，发酵时间为45h-48h(如45h-46h、47h-48h、45h、46h、47h或48h)。
所述发酵体系中，所述复合菌剂的活性成分含量具体可为2.00×107cfu/g，其中所述枯草芽孢杆菌的含量为0.67×107cfu/g，所述酿酒酵母的含量为1.34×107cfu/g，此时所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母的菌落形成单位比为1：2。
所述发酵体系中，所述复合菌剂的活性成分含量具体可为6.00×107cfu/g，其中所述枯草芽孢杆菌的含量为1.94×107cfu/g，所述酿酒酵母2.1190的含量为4.06×107cfu/g，此时所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母的菌落形成单位比为1：2.1。
所述发酵体系中，所述复合菌剂的活性成分含量具体可为4.00×107cfu/g，其中所述枯草芽孢杆菌的含量为1.25×107cfu/g，所述酿酒酵母的含量为2.75×107cfu/g，此时所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母的菌落形成单位比为1：2.2。
所述步骤(2)中，所述“进行水提”的步骤如下：将所述发酵产物通风干燥，粉碎，得到发酵产物粉末；向1质量份所述发酵产物粉末中加入20-25质量份(如20质量份或25质量份)水进行提取，离心，得到水提液。所述通风干燥的温度可为30℃-40℃(如30℃或40℃)。所述粉碎的筛网目数具体可为60目。所述提取可为静置提取。所述提取温度为80℃-90℃(如80℃-85℃、85℃-90℃、80℃、85℃或90℃)。所述提取时间为30min-60min(如30min-40min、40min-60min、30min、60min或40min)。所述离心的参数可为6000rpm-7000rpm离心5min-20min。所述离心的参数具体可为6000rpm离心10min。所述离心的参数具体可为7000rpm离心10min。
所述步骤(3)中，所述“进行醇沉”的步骤如下：向1体积份所述水提液中加入3-4体积份(如3体积份或4体积分)90-95％(v/v)乙醇水溶液(90％(v/v)乙醇水溶液或95％(v/v)乙醇水溶液)进行醇沉，离心，收集沉淀；将所述沉淀通风干燥，得到活性多糖。所述醇沉时间为24h-48h(如24h-36h、36h-48h、24h、36h或48h)。所述离心的参数可为6000rpm-7000rpm离心5min-20min。所述离心的参数具体可为6000rpm离心10min。所述离心的参数具体可为7000rpm离心10min。所述通风干燥的温度可为30℃-35℃(如30℃或35℃)。
采用上述任一所述方法制备的活性多糖也属于本发明的保护范围。
上述任一所述复合菌剂，或，上述任一所述发酵原料在制备活性多糖中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述复合菌剂或上述任一所述发酵原料；上述任一所述复合菌剂或上述任一所述发酵原料用于制备活性多糖。
上文中，所述枯草芽孢杆菌具体可为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmcc1.0892。所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmcc2.1190。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmcc1.0892和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmcc2.1190均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)的菌种。
上文中，所述活性多糖的单糖组分有葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖。各个单糖的质量比依次为：176.39：54.63：22.13：13.39：7.79：6.34：1.18、或、182.01：56.14：18.56：11.71：7.81：4.87：1.02、或、183.21：59.01：20.66：12.00：6.58：5.66：2.01。
实验证明，采用本发明提供的方法可以制备活性多糖，具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中测定活性多糖对dpph自由基的清除能力采用dpph自由基法(记载于如下文献中：葛丽花.阿魏酸低聚糖的制备及其抗氧化性质的研究[d].哈尔滨：东北林业大学，2007)，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水分别稀释活性多糖，得到浓度为0.01mg/ml的多糖溶液1、浓度为0.10mg/ml的多糖溶液2、浓度为0.50mg/ml的多糖溶液3、浓度为1.00mg/ml的多糖溶液4、浓度为5.00mg/ml的多糖溶液5和浓度为10.00mg/ml的多糖溶液6。
(2)取2ml多糖溶液(多糖溶液1、多糖溶液2、多糖溶液3、多糖溶液4、多糖溶液5或多糖溶液6)，加入2ml浓度为2mmol/l的dpph乙醇溶液，混匀，室温静置30min，然后测定在517nm处吸光度ai。
(3)将1.58mgdpph和2ml无水乙醇混合，然后测定在517nm处吸光度ac。
(4)取2ml多糖溶液，加入2ml无水乙醇，混匀，室温静置30min，然后测定在517nm处吸光度aj。
(5)按照下述公式计算多糖溶液对dpph自由基的清除率；清除率越高，则多糖溶液对dpph自由基的清除能力越强；
清除率＝{1-(ai-aj)/ac}×100％。
下述实施例中测定活性多糖对羟自由基的清除能力采用水杨酸法(记载于如下文献中：王希.大麦多糖的提取及其生物活性研究[d].南京：江苏大学，2008)，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水分别稀释活性多糖，得到浓度为0.01mg/ml的多糖溶液1、浓度为0.10mg/ml的多糖溶液2、浓度为0.50mg/ml的多糖溶液3、浓度为1.00mg/ml的多糖溶液4、浓度为5.00mg/ml的多糖溶液5和浓度为10.00mg/ml的多糖溶液6。
(2)取2ml多糖溶液(多糖溶液1、多糖溶液2、多糖溶液3、多糖溶液4、多糖溶液5或多糖溶液6)，加入0.5ml浓度为9mmol/l的feso4水溶液和2ml浓度为8.8mmol/l的h2o2水溶液，混匀，室温静置10min；然后加入2ml浓度为9mmol/l的水杨酸乙醇溶液，混匀，室温静置30min；最后测定在510nm处吸光度ai。
(3)按照上述步骤(2)的方法，将浓度为9mmol/l的水杨酸乙醇溶液替换为蒸馏水，其它步骤均不变，得到吸光度aj。
(4)按照上述步骤(2)的方法，将多糖溶液替换为蒸馏水，其它步骤均不变，得到吸光度ao。
(5)按照下述公式计算多糖溶液对羟自由基的清除率；清除率越高，则多糖溶液对羟自由基的清除能力越强；
清除率＝{1-(ai-aj)}/ao×100％。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmcc1.0892和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmcc2.1190均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)的菌种。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)cgmcc1.0892在下文中简称枯草芽孢杆菌1.0892。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmcc2.1190在下文中简称酿酒酵母2.1190。
营养肉汤液体培养基和麦芽汁培养基均为广东环凯微生物科技有限公司的产品。
实施例1、采用培养基甲和复合菌剂甲制备活性多糖
一、制备复合菌剂甲
复合菌剂甲的制备方法如下：
1、枯草芽孢杆菌1.0892种子液甲的制备
将枯草芽孢杆菌1.0892接种于营养肉汤液体培养基，然后34-35℃培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌1.0892种子液甲。枯草芽孢杆菌1.0892种子液甲中，枯草芽孢杆菌1.0892的浓度为2.0×108cfu/ml。
2、酿酒酵母2.1190种子液甲的制备
将酿酒酵母2.1190接种于麦芽汁培养基，然后31-33℃培养18-24h，得到酿酒酵母2.1190种子液甲。酿酒酵母2.1190种子液甲中，酿酒酵母2.1190的浓度为2.0×108cfu/ml。
3、复合菌剂甲的制备
将1体积份的枯草芽孢杆菌1.0892种子液甲和2体积份的酿酒酵母2.1190种子液甲混合，得到复合菌剂甲；复合菌剂甲中，枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的菌落形成单位(cfu)比为1:2。
复合菌剂甲的活性成分含量为每毫升复合菌剂甲中枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的含量之和，为2.0×108cfu/ml。每毫升复合菌剂甲中枯草芽孢杆菌1.0892的含量为0.67×108cfu/ml。每毫升复合菌剂甲中酿酒酵母2.1190的含量为1.34×108cfu/ml。
二、制备培养基甲
1、原料预处理
(1)取无霉变的麸皮，过20目筛，留取筛上麸皮。在下文中，留取的筛上麸皮命名为筛后麸皮。
(2)将豆粕粉碎，过40目筛，留取筛下豆粕粉。在下文中，留取的筛下豆粕粉简称为豆粕粉。
(3)将干玉米粉碎，过40目筛，留取筛下玉米粉。在下文中，留取的筛下玉米粉简称为玉米粉。
2、制备培养基甲
(1)将78质量份的筛后麸皮、10质量份的豆粕粉、12质量份的玉米粉和0.15质量份的尿素混合(ph值自然)，得到发酵原料甲。
(2)将发酵原料甲和等质量的蒸馏水(即m/m＝1：1)混合，121℃灭菌20min，冷却后，得到培养基甲。
三、制备活性多糖
1、将培养基甲和复合菌剂甲按照质量体积比10:1(10g/1ml)混合，得到发酵体系甲。发酵体系甲中，枯草芽孢杆菌1.0892的含量为0.67×107cfu/g，酿酒酵母2.1190的含量为1.34×107cfu/g。
2、完成步骤1后，将发酵体系甲置于35℃的条件下，发酵45h，得到发酵产物甲。
3、完成步骤2后，将发酵产物甲置于30℃通风干燥，然后粉碎(筛网目数：60目)，得到粒度小于0.3cm的发酵产物粉末甲。
4、完成步骤3后，取1质量份发酵产物粉末甲，加入20质量份蒸馏水，静置提取30min(提取温度为80℃)，然后6000rpm离心10min，收集的上清液即为水提液甲。
5、完成步骤4后，取1体积份水提液甲，加入3体积份90％(v/v)的乙醇水溶液，醇沉24h，然后6000rpm离心10min，收集沉淀甲。将所述沉淀甲置于30℃鼓风干燥，得到物质甲。
采用hplc衍生化法分析物质甲的单糖组分。结果表明，物质甲中的单糖组分有葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖，质量比依次为：176.39：54.63：22.13：13.39：7.79：6.34：1.18。可见，物质甲是一种活性多糖。
测定步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基的清除能力，实验结果见表1。结果表明，步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基有良好的清除作用。
表1
实施例2、采用培养基乙和复合菌剂乙制备活性多糖
一、制备复合菌剂乙
复合菌剂乙的制备方法如下：
1、枯草芽孢杆菌1.0892种子液乙的制备
将枯草芽孢杆菌1.0892接种于营养肉汤液体培养基，然后34-35℃培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌1.0892种子液乙。枯草芽孢杆菌1.0892种子液乙中，枯草芽孢杆菌1.0892的浓度为6.0×108cfu/ml。
2、酿酒酵母2.1190种子液乙的制备
将酿酒酵母2.1190接种于麦芽汁培养基，然后31-33℃培养18-24h，得到酿酒酵母2.1190种子液乙。酿酒酵母2.1190种子液乙中，酿酒酵母2.1190的浓度为6.0×108cfu/ml。
3、复合菌剂乙的制备
将1体积份的枯草芽孢杆菌1.0892种子液乙和2.1体积份的酿酒酵母2.1190种子液乙混合，得到复合菌剂乙；复合菌剂乙中，枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的菌落形成单位(cfu)比为1:2.1。
复合菌剂乙的活性成分含量为每毫升复合菌剂乙中枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的含量之和，为6.0×108cfu/ml。每毫升复合菌剂乙中枯草芽孢杆菌1.0892的含量为1.94×108cfu/ml。每毫升复合菌剂乙中酿酒酵母2.1190的含量为4.06×108cfu/ml。
二、制备培养基乙
1、原料预处理
(1)取无霉变的麸皮，过20目筛，留取筛上麸皮。在下文中，留取的筛上麸皮命名为筛后麸皮。
(2)将豆粕粉碎，过40目筛，留取筛下豆粕粉。在下文中，留取的筛下豆粕粉简称为豆粕粉。
(3)将干玉米粉碎，过40目筛，留取筛下玉米粉。在下文中，留取的筛下玉米粉简称为玉米粉。
2、制备培养基乙
(1)将80质量份的筛后麸皮、10质量份的豆粕粉、10质量份的玉米粉和0.15质量份的尿素混合(ph值自然)，得到发酵原料乙。
(2)将发酵原料乙和等质量的蒸馏水(即m/m＝1：1)混合，121℃灭菌20min，冷却后，得到培养基乙。
三、制备活性多糖
1、将培养基乙和复合菌剂乙按照质量体积比9:1(9g/1ml)混合，得到发酵体系乙。发酵体系乙中，枯草芽孢杆菌1.0892的含量为1.94×107cfu/g，酿酒酵母2.1190的含量为4.06×107cfu/g。
2、完成步骤1后，将发酵体系乙置于35℃的条件下，发酵45h，得到发酵产物乙。
3、完成步骤2后，将发酵产物乙置于30℃通风干燥，然后粉碎(筛网目数：60目)，得到粒度小于0.3cm的发酵产物粉末乙。
4、完成步骤3后，取1质量份发酵产物粉末乙，加入20质量份无菌水，静置提取30min(提取温度为85℃)，然后6000rpm离心10min，收集的上清液即为水提液乙。
5、完成步骤4后，取1体积份水提液乙，加入3体积份90％(v/v)的乙醇水溶液，醇沉24h，然后6000rpm离心10min，收集沉淀乙。将所述沉淀乙置于30℃鼓风干燥，得到物质乙。
采用hplc衍生化法分析物质乙的单糖组分。结果表明，物质乙中的单糖组分有葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖，质量比依次为：182.01：56.14：18.56：11.71：7.81：4.87：1.02。可见，物质乙是一种活性多糖。
测定步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基的清除能力，实验结果见表2。结果表明，步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基有良好的清除作用。
表2
实施例3、采用培养基丙和复合菌剂丙制备活性多糖
一、制备复合菌剂丙
复合菌剂丙的制备方法如下：
1、枯草芽孢杆菌1.0892种子液丙的制备
将枯草芽孢杆菌1.0892接种于营养肉汤液体培养基，然后34-35℃培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌1.0892种子液丙。枯草芽孢杆菌1.0892种子液丙中，枯草芽孢杆菌1.0892的浓度为4.0×108cfu/ml。
2、酿酒酵母2.1190种子液丙的制备
将酿酒酵母2.1190接种于麦芽汁培养基，然后31-33℃培养18-24h，得到酿酒酵母2.1190种子液丙。酿酒酵母2.1190种子液丙中，酿酒酵母2.1190的浓度为4.0×108cfu/ml。
3、复合菌剂丙的制备
将1体积份的枯草芽孢杆菌1.0892种子液丙和2.2体积份的酿酒酵母2.1190种子液丙混合，得到复合菌剂丙；复合菌剂丙中，枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的菌落形成单位(cfu)比为1:2.2。
复合菌剂丙的活性成分含量为每毫升复合菌剂丙中枯草芽孢杆菌1.0892和酿酒酵母2.1190的含量之和，为4.0×108cfu/ml。每毫升复合菌剂丙中枯草芽孢杆菌1.0892的含量为1.25×108cfu/ml。每毫升复合菌剂丙中酿酒酵母2.1190的含量为2.75×108cfu/ml。
二、制备培养基丙
1、原料预处理
(1)取无霉变的麸皮，过20目筛，留取筛上麸皮。在下文中，留取的筛上麸皮命名为筛后麸皮。
(2)将豆粕粉碎，过40目筛，留取筛下豆粕粉。在下文中，留取的筛下豆粕粉简称为豆粕粉。
(3)将干玉米粉碎，过40目筛，留取筛下玉米粉。在下文中，留取的筛下玉米粉简称为玉米粉。
2、制备培养基丙
(1)将82质量份的筛后麸皮、8质量份的豆粕粉、9质量份的玉米粉和0.25质量份的尿素混合(ph值自然)，得到发酵原料丙。
(2)将1质量份发酵原料丙和1.15质量份的蒸馏水(即m/m＝1：1.15)混合，121℃灭菌20min，冷却后，得到培养基丙。
三、制备活性多糖
1、将培养基丙和复合菌剂丙按照质量体积比10:1(10g/1ml)混合，得到发酵体系丙。发酵体系丙中，枯草芽孢杆菌1.0892的含量为1.25×107cfu/g，酿酒酵母2.1190的含量为2.75×107cfu/g。
2、完成步骤1后，将发酵体系丙置于36℃的条件下，发酵48h，得到发酵产物丙。
3、完成步骤2后，将发酵产物丙置于40℃通风干燥，然后粉碎(筛网目数：60目)，得到粒度小于0.3cm的发酵产物粉末丙。
4、完成步骤3后，取1质量份发酵产物粉末丙，加入25质量份无菌水，静置提取60min(提取温度为90℃)，然后7000rpm离心10min，收集的上清液即为水提液丙。
5、完成步骤4后，取1体积份水提液丙，加入4体积份95％(v/v)的乙醇水溶液，醇沉48h，然后7000rpm离心10min，收集沉淀丙。将所述沉淀丙置于35℃鼓风干燥，得到物质丙。
采用hplc衍生化法分析物质丙的单糖组分。结果表明，物质丙中的单糖组分有葡萄糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖，质量比依次为：183.21：59.01：20.66：12.00：6.58：5.66：2.01。可见，物质丙是一种活性多糖。
测定步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基的清除能力，实验结果见表3。结果表明，步骤三制备的活性多糖对dpph自由基和羟自由基有良好的清除作用。
表3