本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤极大地危害人类的健康，是全球性的公共卫生问题之一。肿瘤的免疫治疗可以刺激机体免疫系统对肿瘤的攻击，端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase，tert)是端粒酶的催化肽亚基，它在超过85％的人类肿瘤细胞内高表达，但在正常体细胞中却表达极低或完全不表达，这使得它成为了肿瘤免疫治疗的理想靶标。用tert特异性细胞毒t淋细胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)免疫小鼠可以触发抗肿瘤细胞毒性t淋巴细胞反应，并且能够杀死tert阳性的多种组织内的肿瘤细胞。通过计算机程序筛选tert氨基酸序列中能够结合人类白细胞抗原ⅰ类或ⅱ类蛋白质，并引发tert特异性免疫应答的表位，发现了许多tert肽，包括抗原表位肽p540、抗原表位肽p572、抗原表位肽p672和抗原表位肽p973等等，单个的抗原表位肽在体外能够使得tert特异性ctl或辅助t细胞应答，但这些tert肽在体内抗肿瘤效果不够理想。技术实现要素：基于此，有必要提供一种体内抗肿瘤效果较好的抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用。一种抗肿瘤的多肽，包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540，所述tert抗原表位肽p572的n-末端和所述tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，所述第一连接片段包括至少三个连接氨基酸，所述连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。在一个实施方式中，所述多肽为：(a)、由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。在一个实施方式中，所述多肽为：(a)、由seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。在一个实施方式中，所述多肽还包括tert抗原表位肽p672和第二连接片段，所述tert抗原表位肽p572、所述第一连接片段、所述tert抗原表位肽p672、所述第二连接片段以及所述tert抗原表位肽p540依次连接，所述tert抗原表位肽p672的n-末端设有起始密码子，所述第二连接片段包括至少三个所述连接氨基酸。在一个实施方式中，所述多肽为：(a)、由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。在一个实施方式中，所述多肽为：(a)、由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。上述的抗肿瘤的多肽的制备方法，包括如下步骤：提供基因表达载体，所述基因表达载体中含有目的基因表达片段，所述目的基因表达片段用于表达抗肿瘤的多肽，所述多肽包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540，所述tert抗原表位肽p572的n-末端和所述tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，所述第一连接片段包括至少三个连接氨基酸，所述连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种；以及将所述基因表达载体转染到宿主细胞中，并对转染后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述抗肿瘤的多肽。在一个实施方式中，所述基因表达载体为腺病毒表达载体pad/cmv/dest，所述目的基因表达片段的核苷酸序列如seqidno.5所示或如seqidno.6所示。上述抗肿瘤的多肽在制备抗肿瘤的药物中的应用。上述抗肿瘤的多肽在制备抗黑素瘤的药物中的应用。上述抗肿瘤的多肽包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540，tert抗原表位肽p572的n-末端和tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，第一连接片段包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。发明人在tert抗原表位肽的选择、抗原表位肽的连接顺序以及连接片段的序列等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540依次连接形成的多肽相比对照组，能够更加有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。附图说明图1为一实施方式的抗肿瘤的多肽的示意图；图2为另一实施方式的抗肿瘤的多肽的示意图；图3为一实施方式的抗肿瘤的多肽的制备方法的流程图；图4为实施例1和实施2中所用的载体pcdna3.1的图谱；图5为实施例1中获得的重组载体psag7的图谱；图6为实施例2中获得的重组载体psag8的图谱；图7为实施例3中小鼠体内注射腺病毒载体radv-sag7、radv-sag8以及radv-egfp后肿瘤体积的统计图；图8为实施例3中小鼠体内注射腺病毒载体radv-sag7、radv-sag8以及radv-egfp后小鼠的生存率的统计图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。请参阅图1，一实施方式的抗肿瘤的多肽的示意图，该抗肿瘤的多肽包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段(linker-1)和tert抗原表位肽p540，tert抗原表位肽p572的n-末端和tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，第一连接片段包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。具体地，第一连接片段(linker-1)包括至少三个连接氨基酸，每个连接氨基酸均选自甘氨酸(缩写为g)、丝氨酸(缩写为s)和丙氨酸(缩写为a)中的一种。本实施方式中，第一连接片段包括三个连接氨基酸，依次为丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸(a-g-g)。其他实施方式中，第一连接片段的氨基酸序列还可以为甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(g-s-g)等等。甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸的氨基酸残基片段较小，既能将抗原表位肽p572与抗原表位肽p540有效的连接，进而表达形成组合的多肽链，又能将抗原表位肽p572与抗原表位肽p540进行分割，不影响相互的免疫性能。tert抗原表位肽p572的n-末端和tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，促进下游基因的表达，从而容易表达获得该抗肿瘤的多肽。起始密码子的碱基例如可以为atg(编码后形成的met氨基酸)等。具体地，当通过载体表达该抗肿瘤的多肽时，该多肽的表达序列上还设有酶切位点例如hindll酶切位点、bamhi酶切位点以及kpnl酶切位点等，以及表达的终止片段(stopcodons)。通过第一连接片段将tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540依次连接形成的抗肿瘤的多肽，能够有效的抑制小鼠体内的肿瘤的生长，使得肿瘤的体积减小，从而应用到治疗肿瘤的药物领域。具体地，该肿瘤的多肽为(a)、由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。进一步地，该肿瘤的多肽为：(a)、由seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。本实施方式中，抗肿瘤的多肽为由seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽，该抗肿瘤的多肽由seqidno.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到。可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此与seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽或至少一种改变(如其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽)，或与seqidno.2所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列或至少一种改变(如编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代，或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)对应的核苷酸序列，如果构建到表达载体中，得到的多肽与本申请中包括tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540依次连接形成的组合多肽链没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。上述抗肿瘤的多肽将tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540依次连接形成的组合多肽链，刺激树突细胞并引发tert特异性ctl或辅助t细胞应答，从而有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。请参阅图2所示的另一实施方式的抗肿瘤的多肽的示意图，与图1所示的抗肿瘤的多肽相比，本实施方式的抗肿瘤的多肽还包括tert抗原表位肽p672和第二连接片段(linker-2)。具体地，tert抗原表位肽p572、第一连接片段、tert抗原表位肽p672、第二连接片段以及tert抗原表位肽p540依次连接，tert抗原表位肽p672的n-末端设有起始密码子，第二连接片段(linker-2)包括至少三个连接氨基酸。起始密码子以及连接氨基酸的具体内容前文已经给出，在此不再重复。具体地，tert抗原表位肽p572、tert抗原表位肽p672、tert抗原表位肽p540均为人源的tert(htert)的抗原表位肽。在小鼠中的实验结果表明，将tert抗原表位肽p572、tert抗原表位肽p672和tert抗原表位肽p540依次连接形成的多肽，对肿瘤的抑制作用更加明显，能够应用到治疗肿瘤的药物领域。具体地，该肿瘤的多肽为(a)、由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。进一步地，该肿瘤的多肽为：(a)、由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。本实施方式中，抗肿瘤的多肽为由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽，该抗肿瘤的多肽由seqidno.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到。可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此与seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽或至少一种改变(如其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽)，或与seqidno.4所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列或至少一种改变(如编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代，或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)对应的核苷酸序列，如果构建到表达载体中，得到的多肽与本申请中tert抗原表位肽p572、第一连接片段、tert抗原表位肽p672、第二连接片段以及tert抗原表位肽p540依次连接形成的组合多肽链没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。实验结果表明，上述抗肿瘤的多肽能够刺激树突细胞并引发tert特异性ctl或辅助t细胞应答，有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。请参阅图3，本申请还提供一种上述的抗肿瘤的多肽的制备方法，包括如下步骤s110～s120。s110、提供基因表达载体，基因表达载体中含有目的基因表达片段，目的基因表达片段用于表达抗肿瘤的多肽，多肽包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540，tert抗原表位肽p572的n-末端和tert抗原表位肽p540的n-末端分别设有起始密码子，第一连接片段包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。具体地，基因表达载体为腺病毒表达载体pad/cmv/dest，目的基因表达片段的核苷酸序列如seqidno.5所示或如seqidno.6所示。其中，如seqidno.5所示的目的基因表达片段包括编码tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540的序列，以及连接tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540的第一连接片段的序列。如seqidno.6所示的目的基因表达片段包括编码tert抗原表位肽p572、tert抗原表位肽p672以及tert抗原表位肽p540的序列，以及编码第一连接片段和第二连接片段的序列。此外，还在基因表达片段的前端增加酶切位点，在基因表达片段的后端增加终止子密码，使得基因表达片段能够顺利表达。具体地，上述设计的目的基因表达片段通过dna合成完成，合成的基因表达片段采用invitrogen公司的zeroblunttopopcr克隆试剂盒转化进入pcr-bluntii-topo载体中克隆。然后克隆的基因表达片通过限制性内切酶(例如hindiii/ecori)酶切后连接到pcdna3.1载体中得到重组载体中。在一个实施方式中，还包括先用pcdna3.1载体对目的基因表达片段进行扩增，获得大量的目的基因表达片段。具体为对将扩增后pcdna3.1重组载体进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将分别将0.105kb片段大小(seqidno.5所示的基因表达片段构建的重组载体)和0.162kb片段大小(seqidno.6所示的基因表达片段构建的重组载体)的目的基因片段进行纯化回收。并将目的基因片段连接到腺病毒表达载体pad/cmv/dest中，得到基因表达载体。该基因表达载体能够用于表达抗肿瘤的多肽。具体地，如seqidno.5所示的基因表达片段能够表达获得如seqidno.1所示的氨基酸序列组成的多肽。如seqidno.6所示的基因表达片段能够表达获得如seqidno.3所示的氨基酸序列组成的多肽。s120、将s110中的基因表达载体转染到宿主细胞中，并对转染后的宿主细胞进行诱导表达，得到抗肿瘤的多肽。具体地，腺病毒表达载体pad/cmv/dest转染到宿主细胞后，表达载体pad/cmv/dest中的目的基因表达片段得以扩增，形成抗肿瘤的多肽。对宿主细胞诱导表达后，收集宿主细胞的裂解液，获得含有抗肿瘤的多肽的腺病毒，并将腺病毒脱盐纯化。具体纯化过程如下：向收集的腺病毒中添加固体氯化铯(cscl)，离心形成密度梯度，按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定，收集富集有腺病毒的组分。将腺病毒装入透析袋，在4℃下透析脱盐过夜纯化，获得纯化的腺病毒。该腺病毒中含有抗肿瘤的多肽，抗肿瘤多肽的序列在前文已经给出，在此不再重复。进一步的，还包括测试纯化的腺病毒的病毒滴度，具体为通过组织培养感染剂量50方法(adeasyvectorsystemapplicationmanual；qbiogene,carlsbad,ca)进行测定。纯化后的腺病毒可储存在病毒储存缓冲液中，置于-80℃冰箱中储存，病毒储存缓冲液具体包括：10mmtris，2mm氯化镁,4％蔗糖，ph8.0。可以理解，上述操作不限于采用上述次序执行，比如基因表达载体可通过购买的方式获得，或根据本发明的构思提前构建好了基因表达载体。上述抗肿瘤的多肽的制备方法，步骤简单，通过制备高效、稳定地表达抗肿瘤的多肽的表达载体，从而获得抗肿瘤的多肽。此外，本文还提供一实施方式的抗肿瘤的多肽在制备抗肿瘤的药物中的应用。进一步地，该抗肿瘤的多肽在制备抗黑素瘤的药物中的应用。上述抗肿瘤的多肽可作为药物，药物中包括上述的抗肿瘤的多肽。抗肿瘤多肽的序列在前文已经给出，在此不再重复。具体地，该抗肿瘤的药物可以是用于预防肿瘤的疫苗，也可以是用于治疗已经确诊为肿瘤甚至癌症的药物。进一步地，该抗肿瘤的药物具体为抗黑素瘤的药物。实验结果表明，上述抗肿瘤的多肽能够刺激树突细胞并引发tert特异性ctl或辅助t细胞应答，有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。因此，该抗肿瘤的多肽可开发成为一种抗肿瘤的药物，在制备治疗肿瘤的药物中具有良好的应用前景。下面为具体实施例部分。以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的的分子克隆实验指南[m](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。实施例1设计与合成包括tert抗原表位肽组合的新型多肽sag7sag7示意图请参阅图1，包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段和tert抗原表位肽p540多肽。sag7的氨基酸序列如seqidno.1所示，sag7的核苷酸序列如seqidno.2所示。根据要表达的tert抗原表位肽组合的新型多肽sag7设计目的基因表达片段，具体为表达sag7的目的基因表达片段包括编码tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540的序列，以及连接tert抗原表位肽p572和tert抗原表位肽p540的第一连接片段的序列。设计时在基因表达片段的前端增加酶切位点，每一个抗原表位之间由编码三个自然和小的氨基酸残基的碱基序列进行分割(第一连接片段与第二连接片段)，为促进下游基因的表达，分别在开始的每个抗原表位肽的序列之前加入一个起始密码子atg，在最后的基因表达片段的后面添加了两个终止密码子，使得基因表达片段能够顺利表达。最后设计的表达sag7的目的基因表达片段含有105对碱基，具体碱基序列如seqidno.5所示。设计的基因表达片段通过dna合成服务公司完成。将seqidno.5所示的目的基因表达片段用invitrogen公司的zeroblunttopopcr克隆试剂盒克隆进入pcr-bluntii-topo载体中。将克隆后的基因表达片段通过hindiii/ecori双酶切位点克隆到pcdna3.1载体cmv启动子的下游。pcdna3.1载体的图谱如图4所示。用pcdna3.1载体对目的基因表达片段进行扩增，获得大量的目的基因表达片段。将酶切后的目的基因表达片段别连接至pcdna3.1相应的酶切位点，从而获得了重组载体psag7(载体结构请参阅图5)，获得重组质粒的连接位点经自动测序仪确认。将重组载体psag7表达的产物进行双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将0.105kb的片段大小的基因产物进行纯化回收，获得目的基因表达片段(表达sag7的cdna)。将目的基因表达片段分别克隆进入腺病毒表达载体pad/cmv/dest(invitrogen)中，从而获得padv质粒(基因表达载体)。将该重组的腺病毒padv质粒转染293a细胞，表达载体pad/cmv/dest中的目的基因表达片段在293a细胞得以扩增，形成抗肿瘤的多肽。对宿主细胞诱导表达后，收集宿主细胞的裂解液，获得含有抗肿瘤的多肽的腺病毒，向腺病毒中添加固体氯化铯(cscl)，离心形成密度梯度，按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有腺病毒的组分。将腺病毒装入透析袋，在4℃下透析脱盐过夜纯化。纯化后获得纯化后的表达sag7的腺病毒(radv-sag7)，该腺病毒中含有抗肿瘤的多肽sag7。纯化后的腺病毒储存在病毒储存缓冲液中，置于-80℃冰箱中储存，病毒储存缓冲液具体包括：10mmtris，2mm氯化镁,4％蔗糖，ph8.0。并通过组织培养感染剂量50方法(adeasyvectorsystemapplicationmanual；qbiogene,carlsbad,ca)测试纯化的腺病毒的病毒滴度。实施例2设计与合成包括tert抗原表位肽组合的新型多肽sag8设计以及合成的方法与实施例1相似，不同的是sag8示意图请参阅图2，包括依次连接的tert抗原表位肽p572、第一连接片段、tert抗原表位肽p672、第二连接片段以及tert抗原表位肽p540。sag8的氨基酸序列如seqidno.3所示，sag8的核苷酸序列如seqidno.4所示。设计的表达sag8的基因表达片段含有162对碱基，具体碱基序列如seqidno.6所示。将seqidno.6所示的基因表达片段用invitrogen公司的zeroblunttopopcr克隆试剂盒克隆进入pcr-bluntii-topo载体中。将克隆后的基因表达片段通过hindiii/ecori双酶切位点克隆到pcdna3.1载体cmv启动子的下游。pcdna3.1载体的图谱如图4所示。酶切后的基因表达片段别连接至pcdna3.1相应的酶切位点，从而获得了重组载体psag8(载体结构请参阅图6)，获得重组质粒的连接位点经自动测序仪确认。将重组载体psag8表达的产物进行双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将0.162kb的片段大小的基因产物进行纯化回收，获得目的基因片段(表达sag8的cdna)。基因片段参见实施例1操作转染进入中293a细胞，纯化后获得表达sag8的腺病毒(radv-sag8)。实施例3tert抗原表位肽组合的新型多肽sag7和sag8对小鼠黑素瘤免疫治疗1)动物、细胞、抗体和试剂雌性c57bl/6小鼠(6～8周龄)在无菌条件下饲养，并根据深圳实验动物单位发布的指南进行饲养。小鼠黑素瘤b16-f1(atcc，crl-6323)在37℃、5％co2环境中培养，培养液dmem中需添加10％热灭活的fbs，培养基中添加100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(invitrogen，carlsbad，ca)。2)制备携带sag7，sag8的重组腺病毒载体(radv-sag7，radv-sag8)以及携带egfp对照的重组腺病毒载体(radv-egfp)参见实施例1和2的方法分别制备携带多肽sag7的重组腺病毒载体radv-sag7，携带多肽sag8的重组腺病毒载体radv-sag8。同样参见实施例1的方法制备携带egfp的重组腺病毒载体(radv-egfp)作为对照组病毒，使用前-80℃保存。3)皮下肿瘤接种在黑素瘤b16细胞指数生长期用胰蛋白酶消化收获，随后用冰冷的pbs洗涤两次，最后以2×106个/ml的细胞浓度重悬于冰冷的pbs中。在c57bl/6小鼠皮下注射b16细胞(2×106个/只)。7天后，将每只肿瘤约0.2cm3～0.4cm3的小鼠每3天接受1回皮下肿瘤内注射腺病毒载体radv-sag7、radv-sag8或radv-egfp，腺病毒载体的病毒滴度为2.5×109pfu。4)统计分析通过公式v＝1/2×s×l计算肿瘤体积(v)，其中s和l分别是肿瘤的最短和最长直径。用student-t检验用于比较实验组之间的肿瘤体积，p<0.05认为具有统计学显著性差异。结果见图7所示，具体的数据如下表1所示。表1：实验组和对照组的小鼠肿瘤体积groupday1day2day3day4day5day6day7day8day9egfp78±16200±35250±35325±50475±60650±55845±60975±751050±80sag780±17135±23195±42270±35375±61405±49430±58615±62640±70sag870±16153±24209±40230±40355±50375±60450±70500±75550±85此外，还统计了实验组和对照组小鼠的生存时间，具体的数据如下表2所示，生存率作图结果见图8所示。表2：实验组和对照组的小鼠的生存时间group(n＝5)survival(days)mediansurvival(days)egfp15,26,32,32,5632sag732，45，60，85，8860sag837,37,67,93,11967实验表明，radv-sag7，radv-sag8能够有效地抑制c57bl/6小鼠中b16黑素瘤的生长(图7，表1)，并延长小鼠的生存时间(图8，表2)。以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>深圳大学<120>抗肿瘤的多肽及其制备方法和应用<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>27<212>prt<213>人工序列<400>1mettyrleuphephetyrarglysservalalaglyglymetileleu151015alalyspheleuhistrpleuglyserglythr2025<210>2<211>81<212>dna<213>人工序列<400>2atgtacctctttttctaccggaagagtgtcgccggcggaatgatcctggccaagttcctg60cactggctgggatccggtacc81<210>3<211>46<212>prt<213>人工序列<400>3mettyrleuphephetyrarglysservalalaglyglymetargpro151015glyleuleuglyalaservalleuglyleuaspaspileglysergly202530metileleualalyspheleuhistrpleuglyserglythr354045<210>4<211>138<212>dna<213>人工序列<400>4atgtacctctttttctaccggaagagtgtcgccggcggaatgcgacccggcctcctgggc60gcctctgtgctgggcctggacgatatcggatccggtatgatcctggccaagttcctgcac120tggctgggatccggtacc138<210>5<211>105<212>dna<213>人工序列<400>5gtaaagcttatgtacctctttttctaccggaagagtgtcgccggcggaatgatcctggcc60aagttcctgcactggctgggatccggtacctgatgaggtaccgta105<210>6<211>162<212>dna<213>人工序列<400>6gtaaagcttatgtacctctttttctaccggaagagtgtcgccggcggaatgcgacccggc60ctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatcggatccggtatgatcctggccaag120ttcctgcactggctgggatccggtacctgatgaggtaccgta162当前第1页12