基于结晶紫酰肼的亚硝酸盐含量测定的制作方法

本发明涉及结晶紫酰肼的制备工艺以及基于结晶紫酰肼的高选择性测定亚硝酸盐的方法。结晶紫酰肼法可用于自来水、湖水等水资源和生物体液及食品中亚硝酸盐含量的测定。

背景技术：

亚硝酸盐在食品工业中已被广泛用作食品添加剂，它的主要功能是抑制食品中微生物、病毒的产生和传播，特别是亚硝酸盐可以防止肉毒杆菌的产生，可提高食用肉制品的安全性。亚硝酸盐也可以改善肉制品的颜色和色泽，因此得到了很多商家的青睐。但近年来，食品中亚硝酸盐超标已成为人们所关注食品安全问题之一。另外，亚硝酸盐还具有广泛的生物活性。血液中的亚硝酸盐含量能够反映出内皮一氧化氮合成酶催化产生no产生的速率，有助于通过与脱氧血红蛋白和血红素蛋白的组织反应形成no来调节血流量。在胃内，no由酸性物质还原亚硝酸盐形成，可以增加胃粘膜屏障厚度和胃血流量。因此建立具有高灵敏度度、高选择性的亚硝酸盐测定方法具有十分重要的意义。

在过去的许多年中已建立了一系列亚硝酸盐的测定方法，包括分光光度法(如griess法)、化学发光及电化学发光法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法。虽然这些方法各有优缺点，但传统的griess方法由于其成本低、方法简单，目前仍居主要地位。然而，这种方法通常比较耗时且灵敏度不高，且容易受到其他离子的干扰。化学发光虽然可以达到较高灵敏度，但稳定性和重现性较差。色谱法(包括毛细管电泳法)测定亚硝酸盐的灵敏度通常较高，但样品制备和衍生化程序需要专用设备，使得这些方法比光谱和电化学方法更昂贵。测定亚硝酸盐的电化学发光方法是近年来新兴的方法，还不很成熟，有待进一步开发。

据此，本发明的目的是提供一种新的测定亚硝酸盐的结晶紫酰肼：2-氨基-6-(二甲氨基)-3-(3-(二甲氨基)苯基)-3-(4-(二甲氨基)苯基)异吲哚。用该结晶紫酰肼来检测亚硝酸盐，以建立一种新的用比色法测定亚硝酸盐的新方法。本发明提供的合成方法简单，产率高，成本低，副产物少。和现有的这些测定亚硝酸盐的方法比较，用本文发明所提供的结晶紫酰肼测定亚硝酸盐具有选择性好、检出限低、方法简单、成本低等优点。

结晶紫酰肼的分子结构式如附图1所示。

技术实现要素：

结晶紫酰肼的合成工艺如下：

本发明直接称取一定量的结晶紫内酯，按比例加入一定体积的无水乙醇和水合联氨，水浴加热，回流2～8h。

以薄层色谱法监控合成反应的进程，所用薄层板为gf254型薄层板，展开剂为(v:v):95％乙醇:乙酸＝10:1。

结晶紫酰肼标准液的配制(1.00mmol/l)：用电子分析天平准确称量0.0430g结晶紫酰肼，放入干燥的小烧杯中，逐滴加入0.2mol/l盐酸(hcl)，边加边搅拌，直至结晶紫酰肼恰好完全溶解。将小烧杯内的溶液转移至100ml容量瓶中，用纯净水定容至刻度并摇匀。

亚硝酸钠溶液(no2^-)的配制：准确称取0.0690g亚硝酸钠，溶解到100ml容量瓶中定容摇匀放置于暗处(可放1月)，其浓度为10.0mmol/l。用移液管准确移取1.00ml10.0mmol/l亚硝酸钠溶液于100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀放于暗处(可存放1星期)，此浓度为0.10mmol/l。取5ml0.10mmol/l亚硝酸钠溶液于100ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀放于暗处(现配现用)，浓度为0.005mmol/l。

氨基乙酸缓冲溶液：配制1mol/l的氨基乙酸-盐酸缓冲溶液，用盐酸调节ph至2.6。

向10ml的比色管中，依次准确加入1mmol/l的结晶紫酰肼溶液适量、1.00ml的亚硝酸盐标准溶液和1ml氨基乙酸缓冲溶液(ph＝2.6)，用纯净水稀释至刻度，摇匀，放置5min后测定其吸光度。

结晶紫酰肼与亚硝酸盐在酸性条件下反应溶液显蓝色，随着亚硝酸盐浓度的逐渐增大，蓝色逐渐加深。

本发明原理如下：

结晶紫内酯和水合肼在乙醇溶剂中反应生成乳白色的结晶紫酰肼。在酸性条件下，结晶紫酰肼和亚硝酸盐反应，因内酰胺环打开而显蓝色。

本发明的优点如下：

(1)该结晶紫酰肼与亚硝酸根反应的速度快，只需要5min便可达到稳定；(2)该结晶紫酰肼对亚硝酸根具有高度的选择性，几乎不受其他常见离子的干扰；(3)可通过肉眼观察反应体系的颜色变化来估计亚硝酸根离子的含量(可视化检测方法)；(5)可以用分光光度对唾液、尿液、泡椒小米辣等样品中亚硝酸盐含量进行准确测定。

附图说明

为了更加明确清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地说明。显然,下面所描述的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为结晶紫酰肼分子结构图；

图2为基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸根反应的稳定时间探究图；

图3为基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸根的反应最佳温度探究图；

图4为基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸根ph对吸光度的影响图；

图5为结晶紫酰肼最佳浓度探究图；

图6为基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸根的标准曲线；

图7为结晶紫内脂和结晶紫酰肼的紫外光谱图。

具体实施方式

本发明的具体实施例1

用电子天平称取2.0g结晶紫内酯于100ml的双口烧瓶中，再加入10ml乙醇，最后逐滴加入5ml80％水合肼(n2h4·h2o)连接好各仪器，在水浴加热下，冷凝回流2小时。在加热20分钟后，溶液呈淡黄色，40分钟左右溶液中有少量白色固体生成。反应完全后等待自然冷却至室温，抽滤，并用乙醇洗涤2～3次，干燥。

本发明的具体实施例2

1)本发明具体实施例2的结晶紫酰肼测亚硝酸盐时的稳定时间如附图2所示，测量所用的亚硝酸根浓度为5×10^-4mmol/l，盐酸浓度为0.02mol/l，结晶紫酰肼的浓度为1mmol/l。从本实验可知此反应只需要5min便可达到稳定，大大提高了实验效率。

2)本发明具体实施例2的基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝盐的反应最佳温度如附图3所示，从此实验可知，基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸根离子浓度几乎不受温度的影响。

3)本发明具体实施例2的基于结晶紫酰肼分光光度法测亚硝酸盐ph对吸光度的影响如附图4所示，分析所用的结晶紫酰肼的浓度为0.1mmol/l，亚硝酸根浓度为5×10^-4mmol/l，用盐酸调ph并用ph计进行测量，最终确定其吸光度最大时溶液的ph＝2.6。

4)本发明具体实施例2的结晶紫酰肼最佳浓度如附图5所示，分析所用的亚硝酸盐浓度为5×10^-3mmol/l，缓冲溶液的ph＝2.6。改变结晶紫酰肼的用量，通过测定观察结晶紫酰肼浓度的改变对吸光度的影响，从而确定最佳结晶紫酰肼的最佳浓度。

5)按照本发明方法，向8支10ml比色管中分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5ml亚硝酸盐标准溶液，再加入本发明所合成的1ml1mmol/l的结晶紫酰肼溶液以及1ml氨基乙酸缓冲溶液(ph＝2.6)，用纯净水定容至刻度，摇匀，等待5min后测定其吸光度并绘制标准曲线(如附图6所示)。

6)样品收集：用纯净水清洗口腔4～5次，让唾液自然的流出到洁净的烧杯内，收集5～6ml唾液样品。取4支10ml比色管各加入1.00ml唾液并分别编号①、②、③、④，向①、②号比色管中加入n-(1-萘基)-乙二胺法的显色剂0.20ml，另外向③、④号加入1.00ml结晶紫酰肼溶液以及1.00ml氨基乙酸缓冲溶液，用纯净水将4支比色管定容至刻度，摇匀，放置5min，用10mm的比色皿，水做参比，于波长540nm处测量①、②号管的吸光度，波长610nm处测量③、④号管的吸光度。两种方法比较其相对标准偏差为2.78％。

本发明的具体实施例3

取6支10ml洁净的比色管分别编号①、②、③、④、⑤、⑥，向每只比色管中加入1mlph＝2.6的缓冲溶液和1ml1mmol/l的结晶紫酰肼溶液，之后向①、②、③号比色管中加入1ml5×10^-3mmol/l的亚硝酸钠标准溶液和1ml经过滤的泡椒小米辣溶液，④、⑤、⑥号比色管中加入1ml5×10^-3mmol/l的亚硝酸钠标准溶液，最后定容摇匀，放置5min后测量其可见光吸收强度，其加标回收率为96.4％。

本发明的具体实施例4

1)样品处理：将火腿肠切碎用研钵将其制成火腿肠泥，准确称取5.0000g火腿肠泥于100ml烧杯中，加入13ml饱和硼酸溶液，用玻璃棒搅匀，用80℃左右的纯净水150ml将其冲洗入250ml的容量瓶中，置沸水浴中加热反应20min。取出一边晃动一边加入0.3g/ml的硫酸锌溶液5ml，以沉淀蛋白质，之后冷却至室温，定容静止片刻，除去上层脂肪过滤，弃去15ml初滤液，收集其余滤液用于下述实验。

2)取6支10ml洁净的比色管分别编号①、②、③、④、⑤、⑥，向每只比色管中加入1mlph＝2.6的缓冲溶液和1ml1mmol/l的结晶紫酰肼溶液，之后向①、②、③号比色管中加入5ml5×10^-3mmol/l的亚硝酸钠标准溶液，向④、⑤、⑥号比色管中加入5ml上述滤液，最后定容摇匀，观察发现比色管中溶液都为蓝色，放置5min，用10mm的比色皿，水做参比，于波长610nm处测量其可见光吸收强度。