一种基于DNA甲基化检测肝癌的试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及基于dna甲基化检测肝癌的试剂盒及应用。
背景技术：
：dna甲基化发生在5'-胞嘧啶位置，主要处于5'-cg-3'核苷酸模式中，通过将s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，并在dna甲基转移酶(dnmt)的催化下，以活性甲基取代cpg二核苷酸中的胞嘧啶环上5'位置的氢，从而转变成5-甲基胞嘧啶(5-mc)。甲基胞嘧啶是对哺乳动物基因组dna唯一的一种化学修饰。作为最重要的表观遗传机制，它在一个新水平揭示了基因组多样性，即：不同组织不同细胞的基因表达，在不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段有不同的甲基化水平。基因组dna上各cpg位点甲基化状态的差异构成基因组dna甲基化谱。由于dna甲基化模式形成过程中呈现的异质性以及组织特异性差异甲基化区域(tissuespecificdifferentiallymethylatedregions，tdmrs)的发现，dna甲基化也开始被逐渐应用在法医学的相关领域。比如在某些基因座，所有组织体细胞都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化，呈现亲源依赖的等位基因甲基化模式。亲源特异性甲基化在细胞世代间的传递。在病理情况下，组织细胞的dna甲基谱发生特异性的改变。dna甲基化改变在许多肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用，可望用于肿瘤早期诊断和类型甚至亚型的区分，例如胃癌、肺癌、前列腺癌症。dna甲基化检测方法飞速发展，高通量测序技术、芯片技术进行全基因组甲基化检测，定量的甲基化质谱检测技术越老越多的技术应用于甲基化研究。随着分子生物学技术特别是高通量测序技术的发展，研究人员从几个位点甲基化到系统地研究甲基化。本专利是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种基于dna甲基化检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包含能检测人体肝特异的试剂。人体有一肝特异的甲基化位点，通过检测，可对肝癌患者进行监测，特别是肝癌早起和肝癌复发患者。所述试剂包含在apoa5基因甲基化位点肝特异区序列的引物。所述引物的核苷酸序列为以下序列中的一种或多种：apoa5-m-f、apoa5-m-r、apoa5-u-f、apoa5-u-r。所述引物具体如下：apoa5-m-f：tttatggggtaaattattattttacgtapoa5-m-r：cctaaaaacttcacttacaaatttccgapoa5-u-f：ttttttttatggaggtaaattttattatttapoa5-u-r：taaaaacttcatctacaaattcctaca。本发明进一步提出地，所述试剂盒还包括apoa5基因甲基化转化试剂和甲基化保护试剂；所述甲基化保护试剂与所述甲基化转化试剂的使用比例为1:5～6；优选地，所述甲基化保护试剂可选用ezdnamethylation-goldkit(zymoresearch)、epitectfastdnabisulfitekite(qiagen)中的一种；优选地，所述甲基化转化试剂可选用ctconversionreagent(catno.d5001-1)(zymoresearch),、bisulfitesolution(lotno.154016700)或dnaprotectbuffer(lotno.154024444,qiagen)中的一种；本发明进一步提出地，所述试剂盒还包括dna聚合酶、dntp及缓冲液；其中，所述dna聚合酶、所述引物、所述dntp、所述缓冲液的体积比例为0.2～0.3:4:3～6:4～6。所述dna聚合酶可选用takaraextaq。本发明进一步提出地，所述引物apoa5-m-f、apoa5-m-r、apoa5-u-f、apoa5-u-r等体积混合。本发明的第二个目的在于，权利要求1-4所述的试剂盒在血液检测中的应用；具体地，在检测人体apoa5基因是否是肝癌样本的应用。所述检测的步骤包括：提取待检测者血液中游离dna，进行dna甲基化转化；将甲基化dna用所述引物进行pcr扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；判断待检测者是否是肝癌样本。所述检测的方法还包括：采集身体正常的检测者的血液，提取血液中游离dna，进行dna甲基化转化；将甲基化dna用所述引物进行pcr扩增反应，经过电泳，制得正常人琼脂糖胶胶图；采集待检测者的血液，制得琼脂糖胶胶图，与所述正常人琼脂糖胶胶图比较。其中，所述提取待检测者血液中游离dna的具体步骤为：提取待检测者血液中游离dna，进行dna甲基化转化；将甲基化dna用所述引物进行pcr扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图。进一步具体为：采集待检测者外周静脉血，用抗凝管在4℃下保存，采集血液两个小内，在4℃下进行离心，1600转/分钟，离心10分钟，取上清液。将获得的上清液进行第二次离心，在4℃下，16000转/分钟，离心10分钟，取上清液。使用dna提取试剂提取游离dna，溶于50μl水。然后用qubit2.0(lifetechnologies,carlsbad,ca)用hsassaykit精确定量。本发明优选dna提取试剂为qiagen(cat.55114)。本发明进一步提出地，所述甲基化转化的反应条件为：在dna提取液内添加dna甲基化保护剂，dna甲基化转化剂，所述甲基化保护剂与所述甲基化转化剂的使用比例为1:5～6，优化为3:17。dna甲基化转化后还需要进一步进行清洗处理；本发明进一提出地，所述pcr扩增反应的体系包括引物apoa5-m-f、引物apoa5-m-r及dna聚合酶；所述引物apoa5-m-f、所述引物apoa5-m-r与所述甲基化dna的添加比例为1:1:3～5。本发明利用软件自行设计引物，经过预实验扩增结果筛选并调整扩增条件，优化反应体系，最终使用优化后的条件进行sybr荧光定量实验；本发明进行dna甲基化转化及pcr扩增反应会根据实际使用的试剂不同，反应程序和试剂用量会有所区别。dna甲基化转化后还需要进行清洗处理也会根据清洗的试剂用量和步骤会有所不同。本发明作为优先方案，一种血液检测具体步骤为：1)用抗凝管采集外周静脉血，首先以1000～2000转/分钟的转速离心后取出上清液，再以10000～20000转/分钟的转速离心，取上清液，使用dna提取试剂提取游离dna，溶于水中，得dna提取液；所述dna提取试剂为qiagen(55114)；2)在dna提取液中加入dna甲基化保护剂，使用dna甲基化试剂对游离dna进行甲基化转化；所述dna甲基化保护剂与所述dna甲基化转化剂的体积比例为3:17；dna甲基化转后后，将甲基化dna进行清洗。3)将甲基化dna用所述引物和dna聚合酶进行pcr扩增反应，经过电泳获得琼脂糖胶胶图；其中所述dna聚合酶与所述引物的体积比例为1:15。本发明是根据高通量测序的实验结果分析出特异性的肝甲基化位点，进行肝癌的检测，特别适用于早期和复发。本方法操作简单，检测准确较高。附图说明图1为实施例1中琼脂糖胶鉴定扩增产物的糖胶图；图2为实施例2中琼脂糖胶鉴定扩增产物的糖胶图；图3为实施例3的荧光定量扩增曲线图；图4为实施例4的荧光定量扩增曲线图；图5为实施例5的荧光定量扩增曲线图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。经供血者同意后，用抗凝管采集正常人和临床上明确诊断为肝癌的患者血液，采血管立即放入冰盒中。按照引物设计原则，使用labli软件在apoa5甲基化位点肝特异区序列区域设计引物:apoa5-m-ftttatggggtaaattattattttacgtapoa5-m-rcctaaaaacttcacttacaaatttccgapoa5-u-fttttttttatggaggtaaattttattatttapoa5-u-rtaaaaacttcatctacaaattcctaca实施例1apoa5基因特异片段的扩增1、游离dna的提取：采集外周静脉血，用抗凝管4℃保存，两个小内进行离心4℃，1600转/分钟，离心10分钟；取出上清液，离心4℃，16000转/分钟，离心10分钟，取上清。使用qiagen(55114)提取游离dna，溶于50μl水。2、dna甲基化转化：用qubit2.0(lifetechnologies,carlsbad,ca)用hsassaykit定量；用epitectfastdnabisulfitekite(cat.no.59824)进行甲基化转化；dna甲基化的反应体系如下表1：表1试剂使用量终浓度dna40ulbisulfitesolution85μl1×dnaprotectbuffer15ul所述dna甲基化转化的反应程序如下表2所示进程：表2过程时间温度解链5分钟99℃孵育20分钟60℃解链5分钟99℃孵育20分钟60℃孵育无限长时间20℃3、dna甲基化转化后清洗处理：加入bl缓冲液560μl(含10mg/mlcarrierrna)，转移到过滤柱(minelutednaspincolumnswithcollectiontubes(lotno.154043001,qiagen)中，13000转/分钟离心1分钟，加入bw500μl洗过滤柱(minelutednaspincolumnswithcollectiontubes(lotno.154043001,qiagen)，加入bd室温孵育15分钟，bw冲洗过滤柱(minelutednaspincolumnswithcollectiontubes(lotno.154043001,qiagen)两次，加纯净水20μl洗下来。4、pcr扩增：采用takara的酶extaq(takara，货号rr001a)按照下列优化后反应条件和进行pcr扩增。表3pcr反应反应体系试剂使用量终浓度takaraextaqhs(5units/μl)0.2510xextaqbuffer5μl1×dntpmixture(2.5mmeach)4dna2.0μl引物m-f2μl引物m-r2μl引物u-f2μl引物u-r2μl纯净水35.0μl具体反应条件为：98℃保持10s，然后55℃保持30s，在72℃保持1min，进行30个循环后，在72℃温度下保持10min。5、琼脂糖胶鉴定扩增产物。在电压140v，电流300a条件下，经1.5％琼脂糖胶检验(如图1的胶图)。经琼脂糖胶发现，每个样品都有扩增，条带单一，长度一致，apoa5-m和apoa5-u的亮度不同。经一代测序验证为apoa5的序列。实施例2实时荧光定量pcr检测apoa5基因方法的建立采用实施例1相同的游离dna的提取、甲基化转化及dna甲基化转化后清洗处理的步骤。pcr扩增：使用itaqtmuniversalgreensupermix(codeno.rr006qbio-rad)扩增表4pcr反应反应体系具体反应条件为：95℃保持5min后；再进行循环，95℃保持15s，然后60℃保持1min，循环45次。进行溶解曲线分析，具体反应条件为：95℃保持15s，60℃保持1min，然后在95℃保持15s，60℃保持15s。实验结果如图3所示荧光定量扩增曲线图，从图3可知，荧光定量曲线成现s型，扩增良好。表5从上述两组平行对比试验的结果显示，阳性样品的扩增良好，呈现s型，apoo5甲基化和非甲基化差别小实施例3实时荧光定量pcr检测甲基化阳性样品的甲基化率建立1、阳性标准品制作：使用cpg甲基转移酶(m.sssi)neb,#m0226)制作甲基化阳性样品，按照标准方法37℃2小时，然后加入稀释后的sam2ul,继续37℃2小时，65℃20分钟灭活，dna量只能加1ul.2、采用实施例1相同的dna甲基化转化及dna甲基化转化后清洗处理的步骤。3、pcr扩增：使用itaqtmuniversalgreensupermix(codeno.rr006qbio-rad)扩增表6pcr反应反应体系具体反应条件为：95℃保持5min后；再进行循环，95℃保持15s，然后60℃保持1min，循环45次。进行溶解曲线分析，具体反应条件为：95℃保持15s，60℃保持1min，然后在95℃保持15s，60℃保持15s。荧光定量的结果显示如图4所示。表7从上述表中结果可知，阳性样品的扩增良好，呈现s型，apoo5甲基化和非甲基化差别很大实施例4实时荧光定量pcr检测肝细胞的甲基化率建立采用实施例1相同的游离dna的提取、甲基化转化及dna甲基化转化后清洗处理的步骤。pcr扩增：使用itaqtmuniversalgreensupermix(codeno.rr006qbio-rad)扩增表8pcr反应反应体系具体反应条件为：95℃保持5min后；再进行循环，95℃保持15s，然后60℃保持1min，循环45次。进行溶解曲线分析，具体反应条件为：95℃保持15s，60℃保持1min，然后在95℃保持15s，60℃保持15s。实验结果如图5所示。表9实施例5临床应用实验1采集肝癌患者的静脉血10份，正常人静脉血10份，采用实施例1相同的游离dna的提取、甲基化转化及dna甲基化转化后清洗处理的步骤，进行荧光定量实验，结果发现，肝癌患者的apoa5的甲基化和非甲基化的差异有明显高于正常人。表10虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京市理化分析测试中心<120>一种基于dna甲基化检测肝癌的试剂盒及应用<130>2017<160>4<170>patentinversion3.3<210>apoa5-m-f<211>27<212>dna<213>人工序列<400>1tttatggggtaaattattattttacgt27<210>apoa5-m-r<211>27<212>dna<213>人工序列<400>2cctaaaaacttcacttacaaatttccg27<210>apoa5-u-f<211>30<212>dna<213>人工序列<400>3ttttttttatggaggtaaattttattattt30<210>apoa5-u-r<211>27<212>dna<213>人工序列<400>4taaaaacttcatctacaaattcctaca27当前第1页12