用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用与流程

本申请涉及地中海贫血检测领域，特别是涉及一种用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用。
背景技术：
：地中海贫血是全世界最常见的遗传病之一，主要分布于地中海地区、中东、印度、东南亚和非洲。地中海贫血也是中国南方最常见、危害最大的遗传病之一。地中海贫血在热带和亚热带，以及中国东南部的发病率达2.5％-15％。其中，据广东省卫生规划委员会统计的数据显示，广东户籍人口中地贫基因携带率约16.8％，同型地贫基因夫妇约占1.7％，每年有超过5000例重型α地贫和1500例重型β地贫的胎儿出生。根据珠蛋白基因缺陷的种类不同，地贫主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。α-地中海贫血主要是α珠蛋白基因(16p13.3)发生点突变或拷贝数变异所导致的，其中95％的α-地中海贫血患者是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致，即缺失型α地贫。目前已鉴定的α-地贫缺失类型至少有36种，其中中国人占8种。东南亚缺失型(--sea)、右侧缺失(-α3.7)和左侧缺失(-α4.2)是中国人最常见的3种缺失型。此外，还有68种α珠蛋白基因点突变可导致α-地中海贫血的发生。β-地中海贫血主要是β珠蛋白基因(11p15)发生突变所导致的，主要以点突变及小的插入或缺失为主，也有大片段缺失的报道。目前已报道有200多种β-珠蛋白基因突变可引起β-地中海贫血的发生。此外，α珠蛋白基因的多倍体重复，如αααanti3.7/αα、αααanti4.2/αα，也会增加β地贫临床症状。而β-珠蛋白基因的缺失会对α地贫的表现有修饰作用。地中海贫血是一种单基因遗传病，若夫妻双方为同型地贫基因携带时，其子女有1/4的机会是中重型地贫患者，有1/2的机会跟父母一样是地贫基因携带者，有1/4是正常的胎儿。此外，多数地贫基因携带者可以不表现出任何临床症状，存在隐蔽性。因此，在婚前、孕前和产前开展地贫携带者筛查、并结合遗传咨询与产前诊断，是降低地贫发病率的最为有效的方法。地中海贫血筛查常用的方法有红细胞与血红蛋白检测方法，如红细胞平均体积法、红细胞脆性试验、血红蛋白电泳分析方等，这些方法灵敏性和特异性较差，存在较大的漏诊率与误诊率。目前，最常用的基于地贫基因检测的筛查与诊断方法是gap-pcr和pcr-rdb，可以检测某地区绝大多数突变和缺失类型，但并不能完全覆盖所有的突变类型，必要时还需采用real-timepcr和sanger测序等技术进行诊断，以降低一些罕见地贫突变或缺失类型的漏检率。但是该方案实验操作复杂、检测费用较高、通量低，不适合用于大规模人群的筛查与诊断。另外，还有些使用点杂交方法检测常见的β点突变，如专利申请cn1718742a中公开的“用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒”，该试剂盒仅能检测中国常见的17种突变类型；专利申请cn1453363a中公开了“用于诊断地中海贫血的dna芯片及其制备方法”，仅能检测在中国发现的21种类型的突变；专利申请cn102115781a中公开的检测方法，仅检测27种β地中海贫血区域。这些方法可检测突变谱有限，无法覆盖所有突变类型，并且，仅能检测已知的突变类型，通量较低、成本较高，不适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查。技术实现要素：本申请的目的是提供一种新的用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及其制备方法和应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于地中海贫血检测的探针的制备方法，包括根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；根据捕获区间库设计捕获探针，对捕获区间库进行高质量和高效率的捕获；捕获区间库包括以下区域，(a)alpha基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括hba1、hba2、hbz、hbq1、hs-40区域，和5’hvr、hvr、3’hvr，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(b)beta基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括hbb、hbd、hbg1、hbg2、hbe1、lcrhs-1、lcrhs-2、lcrhs-3、lcrhs-4和lcrhs-5，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(c)以已有记录的缺失型alpha地贫突变断点及缺失型beta地贫突变断点作为目标捕获区域；(d)以已记录的缺失型alpha突变所涉及的最大的缺失范围为目标，在其范围内，每隔1kb选取1个snp位点，所选snp位点在dbsnp中记录的maf在0.3-0.5之间，同时，所选snp位点所在序列在基因组上无其它高度同源序列，以所选的snp位点作为目标捕获区域；(e)以地贫修饰基因上一系列的snp位点为目标捕获区域，其中，地贫修饰基因包括bcl11a、hbs1l、myb、klf1、bcl11a和myb-hbs1lintergenic。需要说明的是，本申请的探针制备方法，针对地中海贫血alpha基因簇和beta基因簇的所有珠蛋白基因和重要调控区域，以及所有缺失型alpha地贫突变断点、缺失型beta地贫突变断点、缺失型alpha突变snp位点，以及地贫修饰基因等一系列的基因和区域进行探针设计，使得制备的探针能够最大程度的覆盖目前所有已知的地中海贫血基因突变；本申请的制备方法获得的探针，不仅能够对所有已知地中海贫血基因突变进行检测，而且还能够用于发现和研究新的地中海贫血基因突变，适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查。还需要说明的是，本申请的制备方法，其关键在于捕获区间库的构建，至于探针的具体设计方案，可以参考现有的基因芯片中探针的设计。为了保障探针设计效果，本申请进一步优选的方案中，对探针设计也进行了限定，详细介绍如下。优选的，捕获探针的长度为50-120bp，捕获探针与杂交区域的变性温度为60-100℃；并且，对于杂交区域的gc含量高于0.6或低于0.3的捕获探针，乘数大于2。其中，乘数大于2是指，理论上所设计的探针的覆盖深度大于2×。更优选的，捕获探针的长度为75bp。更优选的，捕获探针与杂交区域的变性温度为80℃。本申请的另一面公开了本申请的制备方法获得的探针。本申请的另一面公开了本申请的探针在制备用于地中海贫血基因突变检测的基因芯片、试剂盒或检测设备中的应用。本申请的再一面公开了一种用于地中海贫血基因突变检测的基因芯片，该基因芯片上固定有本申请的探针。本申请的再一面公开了一种用于地中海贫血基因突变检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的探针，或者本申请的基因芯片。需要说明的是，本申请的探针或者基因芯片，可以对地中海贫血进行高通量的检测，并且实验操作简单，且能够覆目前所有已知的地中海贫血基因突变，特别适用于大规模人群的筛查与诊断，因此，可以将探针或基因芯片制成试剂盒，方便使用。不仅如此，本申请的探针或者基因芯片，还能够用于新基因突变的研究和分析，可以作为地中海贫血基因突变研究的工具。本申请的再一面公开了一种地中海贫血基因突变的检测方法，包括采用tn5转座酶对待测样品的基因组dna进行文库构建，并采用本申请的探针或基因芯片对所构建的文库进行地中海贫血基因及其相关修饰基因、调控基因或区域进行富集，然后，对富集产物进行高通量测序。需要说明的是，本申请的检测方法，一方面，使用tn5转座酶进行文库构建，极大的提高了样本检测的通量和地中海贫血基因检测的效率；另一方面，采用本申请的探针或基因芯片对地中海贫血基因及其相关基因和区域进行捕获富集，使得检测结果不仅能够涵盖目前所有已知的地中海贫血基因突变，还能够检测出新的未知的基因突变；再一方面，本申请结合tn5转座酶建库和高通量测序，提高了检测的准确性和检测通量，降低了检测成本，并且，实验操作简单。因此，本申请的地中海贫血基因突变的检测方法，不仅能够适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查；而且还能够用于研发新的未知的地中海贫血基因突变。优选的，采用tn5转座酶进行文库构建的接头序列包括tn5merev、tn5me-a和tn5me-b，tn5merev为seqidno.1所示序列，tn5me-a为seqidno.2所示序列，tn5me-b为seqidno.3所示序列。优选的，高通量测序采用的索引序列为n5索引序列和n7索引序列，n5索引序列包括seqidno.4至seqidno.33所示序列，n7索引序列包括seqidno.34至seqidno.63所示序列。优选的，本申请的检测方法还包括采用已知的地中海贫血基因突变对所有检测到的基因突变进行标注；对检测到的没有标注的基因突变，进行人群频率注释和功能预测。需要说明的是，本申请的检测方法不仅能够覆盖目前所有的地中海贫血基因突变，而且还能够检测出新的未知的地中海贫血基因突变；因此，对未知的地中海贫血基因突变进行人群频率注释和功能预测，以便于发现新的未知的致病突变。本申请的有益效果在于：本申请的探针制备方法，针对地中海贫血所有基因簇及其相关基因和区域进行探针设计，使得制备的探针能覆盖目前所有地中海贫血基因突变。本申请的探针，结合tn5转座酶建库和高通量测序检测地中海贫血基因突变，不仅能够覆盖所有突变类型，而且操作简单方便、通量高、成本低，适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查，以及新的未知基因突变的研究和预测。附图说明图1是本申请实施例中splitreads检测原理示意图；图2是本申请实施例中样本1的cnv检出示意图；图3是本申请实施例中样本2的cnv检出示意图；图4是本申请实施例中样本3的cnv检出示意图。具体实施方式本申请的地中海贫血基因突变检测方法是在本申请的探针基础上提出的，并结合tn5转座酶建库和高通量测序检测。其中，探针的制备方法包括，对地中海贫血所有基因簇及其相关基因和区域进行探针设计，以此保障所设计的探针能够最大程度的覆盖所有已知的地中海贫血基因突变。tn5转座酶建库，能够极大的提高样本检测通量和地中海贫血基因的检测效率。高通量测序，能够简单有效，且准确的对所有基因突变进行检测，包括所有已知的基因突变和一些未知的基因突变，这有利于新型未知地中海贫血基因突变的检测和识别。采用高通量测序对基因突变进行检测，主要是通过对测序结果进行生物信息分析实现的，对测序信息进行分析和研究，以得到相关基因的单核苷酸变异(缩写snv)、少数碱基的插入和缺失(缩写indel)、dna拷贝数变异(缩写cnv)、结构变异(缩写sv)等遗传变异信息。原理如下：cnv检测原理：采用基于区域reads测序深度的拷贝数变异分析。除本身就是基因组上重复的序列以外，基因组上的一段区域发生缺失或者重复后，会在测序深度上产生明显的变化，例如，重复了n次的序列深度会变为正常两拷贝时的大约n/2倍，而杂合缺失和纯合缺失则分别变为大约1/2倍或接近0，根据这一特性，在对测序深度的信号进行gc修正后，再利用样本间的深度相关性，可以将深度信号发生异常的区间识别出来，并做相应的拷贝数预测和可信度评估。结构变异检测原理：当reads本身覆盖到发生sv的断点时，reads本身的序列以断点为界被分为二段，并且对于同一个sv，当有呈不同断开情况的reads支持在同一个断点上，例如，对于图1中a图所示的deletion情况，在实验测序得到的reads在比对过程中，这样的read会被明显的被识别为两部分，其中主要的一部分记为正确比对的部分，第二段的另一部分通常是没法比对上的，但却具有较高的质量值，将其记为softclip部分，这样的部分通常就对应着translocation、deletion等sv的发生，如图1中的b图所示；将softclip的部分取出来单独分析，在基于softclipreads长度，测序质量等等过滤条件下，挑选出高可信的clipreads，将其重新比对得到的断开处的比对位置和原始reads的断点位置进行分析和统计，就可以检出sv发生的具体情况，如图1中的c图所示，对于缺失的检出可以直接给出精确的位置和长度，对于重复结合cnv结果的判断可以精确判断发生重复的长度，位置和重复类型。下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例本例首先设计了用于地中海贫血基因突变检测的探针，并制备了相应的基因芯片；然后结合tn5转座酶建库和高通量测序，对2例地中海贫血患者和1例携带hbb致病突变复合alpha缺失型的个体进行基因检测。具体如下：一、探针和基因芯片制备本例根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；根据捕获区间库设计捕获探针，对捕获区间库进行高质量和高效率的捕获；捕获区间库包括以下区域，(a)alpha基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括hba1、hba2、hbz、hbq1、hs-40区域，和5’hvr、hvr、3’hvr，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(b)beta基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括hbb、hbd、hbg1、hbg2、hbe1、lcrhs-1、lcrhs-2、lcrhs-3、lcrhs-4和lcrhs-5，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(c)以已有记录的缺失型alpha地贫突变断点及缺失型beta地贫突变断点作为目标捕获区域；(d)以已记录的缺失型alpha突变所涉及的最大的缺失范围为目标，在其范围内，每隔1kb选取1个snp位点，所选snp位点在dbsnp中记录的maf在0.3-0.5之间，同时，所选snp位点所在序列在基因组上无其它高度同源序列，以所选的snp位点作为目标捕获区域；(e)以地贫修饰基因上一系列的snp位点为目标捕获区域，其中，地贫修饰基因包括bcl11a、hbs1l、myb、klf1、bcl11a和myb-hbs1lintergenic。本例的探针设计原则如下：(1)探针的长度为50-120bp，本例优选为75bp；(2)探针能够特异性识别各目标区域；(3)特异性识别gc含量高于0.6或低于0.3的区域的探针，乘数大于2；(4)探针与目标序列的熔解温度为60-100摄氏度，本例优选为80摄氏度；(5)探针不包含发夹结构；(6)探针与参考基因组上的至多2个位点匹配；(7)探针选择时的窗口滑动大小为10bp。本例针对地中海贫血相关的基因或区域设计探针，基因及区域包括α-地贫蛋白编码基因：hba1、hba2、hbq1、hbz；α-地贫调控区域：5'hvr、hs40、hvr、3'hvr；α-地贫相关的cnv：sea、3.7、4.2、thai、fil等；β-地贫蛋白编码基因：hbb、hbd、hbe1、hbg1、hbg2；α-地贫调控区域：lcrhs-1到hs-5；α-地贫相关的cnv：chinese、(sea)-hpfh等；地贫修饰基因与变异：klf1、bcl11a、hbs1l、myb，bcl11a基因的12个snp，myb-hbs1lintergenic的16个snp。探针数量共计5571条，基因芯片由华大智造合成。二、tn5转座酶建库1.样本dna提取对取自2例地中海贫血患者和1例携带hbb个体的外周血，分别进行基因组dna提取，本例采用磁珠法提取基因组dna，并使用电泳和od对获得的基因组dna进行质量检测。3个dna样本的电泳和od结果如表1所示。表1dna样本的电泳观察结果和od检测结果样本浓度(ng/μl)体积(μl)od260/280od260/230样本完整性样本128.86501.440.66轻微降解样本232.58501.460.62轻微降解样本338.1501.480.68轻微降解表1中，样本1和样本2是分别取自2例地中海贫血患者的外周血dna，样本3是取自1例携带hbb个体的外周血dna，样本完整性是通过电泳观察得出的，结果显示，虽然三个样本都有轻微降解，但dna浓度较佳，可以用于后续试验。2.tn5转座酶文库制备(1)接头(adaptermix)制备设计并合成tn5建库所需接头，并对接头进行混合，制备adaptermix。本例的tn5建库接头包括tn5merev、tn5me-a和tn5me-b，tn5merev为seqidno.1所示序列，其5’端具有磷酸化修饰，tn5me-a为seqidno.2所示序列，tn5me-b为seqidno.3所示序列。seqidno.1：5’-[phos]ctgtctcttatacacatct-3’seqidno.2：5’-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-3’seqidno.3：5’-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag-3’使用annealingbuffer分别溶解tn5merev、tn5me-a、tn5me-b至终浓度100μm，并分别配置如下体系：体系一：100μm的tn5merev10μl、100μm的tn5me-a10μl，总计20μl；体系二：100μm的tn5merev10μl、100μm的tn5me-b10μl，总计20μl；分别将两个体系的溶液涡旋震荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底，置于pcr仪内，进行如下反应程序：75℃15min、60℃10min、50℃10min、40℃10min、25℃30min。反应结束后，将体系一和体系二等体积混合，混匀，命名为adaptermix，于-20℃保存备用。(2)adaptermix包埋在灭菌pcr管中依次添加各反应组分：adaptermix12.5μl、浓度0.75mg/ml的tn5转座酶87.5μl；使用移液器轻轻吹打，充分混匀。将反应体系置于25℃反应60min。反应产物命名为tagmentenzymeadvancedmixv5s，置于-20℃保存备用。3.dna片段化在室温条件下解冻5×taps-dmfbuffer，上下颠倒混匀后备用；确认0.2％sds处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，于37℃加热并剧烈震荡充分混匀沉淀即溶解。在灭菌pcr管中依次添加各反应组分：5×taps-dmfbuffer4μl、基因组dna1μl约50ng、tagmentenzymeadvancedmixv5s0.3μl，最后用去离子水补齐至20μl。反应体系配制好后，在55℃温浴7min，然后添加5μl0.1％sds室温7min，终止反应，置于冰上，总体积20μl用于后续pcr反应。4.片段化产物pcr扩增设计index序列并合并，本例具体采用了n5索引序列和n7索引序列，部分索引序列的具体序列如表2所示。表2n5索引序列和n7索引序列的部分序列将灭菌pcr管置于冰浴中，依次添加表3所示的各反应组分。表3建库pcr反应体系使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。将pcr管置于pcr仪中，设置如下反应程序：105℃热盖开启，72℃3min，95℃3min，然后进入6个循环：98℃20s、60℃30s、72℃20s，循环结束后72℃5min，4℃待机。上述扩增产物用柱式或磁珠式纯化，即获得单个样本的tn5转座酶文库。三、基因芯片杂交捕获本例采用“一、探针和基因芯片制备”中合成的基因芯片，对tn5转座酶文库进行地中海贫血基因及其相关基因和区域进行杂交捕获。具体步骤和操作参照nimblegen使用说明书进行，杂交洗脱产物即地中海贫血基因及其相关基因和区域。对杂交洗脱产物进行pcr扩增富集，然后用于高通量测序。pcr扩增富集反应体系：杂交捕获的dna20μl，2×kapahifihotstartreadymixr2.5μl，10μm的flowcellprimersf2.5μl，10μm的flowcellprimersr2.5μl，补充灭菌蒸馏水至30μl。pcr反应程序为，98℃预变性45s，然后进入14个循环：98℃15s、65℃30s、72℃30s；循环结束后72℃延伸60s，4℃待机。四、上机测序本例采用hiseq4000pe101+8+101程序进行上机测序。五、信息分析和结果测序仪获取原始短序列；去除测序数据中的接头和低质量数据；将短序列定位到人类基因组数据相应的位置上；统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等；过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸；确定突变位点发生的基因、坐标、氨基酸改变等；进行cnv分析及断裂点的分析。结果显示，三个样本的目标区域覆盖度如表4所示。表4目标区域覆盖度对目标区域捕获进行统计，由表4的结果可见，三个样本目标区域的平均10×覆盖度在98％以上，20×覆盖度在98％以上，表明所设计的探针能够有效捕获目标区域，满足进行分析的要求。检测结果显示，sample1样品在chr11:5191114-5270053间存在杂合缺失，涉及hbb基因，如图2所示。同时有11条splitreads支持在chr11:5191128-5270051区间有78939bp的缺失。split支持断点与chinese型缺失记录断点大致相同，提示该样品为chinese型杂合缺失。同时该样本中还检出了hbb基因常见突变c.126_129delcttt(半合型)，突变等位基因深度为88×。即该样本中检出了beta地贫相关的chinese型缺失与c.126_129delcttt复合杂合突变。对于sample2样本，检测结果表明在16号染色体上新观察到chr16:216336-234626间有杂合缺失，涉及hbm、hba2、hba2、hbq1基因，如图3所示。同时有9条splitreads支持在chr16:215395-234700区间存在19304bp缺失，断点与sea型缺失相同，提示该样品还存在sea型杂合缺失。此外，对于该样本，在chr16:223303-226996区间存在约3.7kb的纯合缺失，与3.7缺失型范围一致，提示该基因存在3.7kb纯合缺失。综合上述分析该样本存在alpha地贫相关的sea与3.7的复合杂合突变。对于sample3样本，检测结果表明在16号染色体上新观察到chr16:216334-234628间有杂合缺失，涉及hbm、hba2、hba2、hbq1基因，如图4所示。同时有13条splitreads支持在chr16:215395-234700区间存在19304bp缺失，断点与sea型缺失相同，提示该样品还存在sea型杂合缺失。此外，检测结果提示该样本样品在hbb基因上存在.316-197c>t杂合突变，为一种常见的hbb突变。可见，本申请的探针和地中海贫血基因突变检测方法，能够有效的对三个样本进行检测，并且检测结果与预期相符。以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。sequencelisting<110>深圳华大基因股份有限公司南方医科大学<120>用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用<130>17i24036<160>63<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1ctgtctcttatacacatct19<210>2<211>33<212>dna<213>人工序列<400>2tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag33<210>3<211>34<212>dna<213>人工序列<400>3gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag34<210>4<211>51<212>dna<213>人工序列<400>4aatgatacggcgaccaccgagatctacactagatcgctcgtcggcagcgtc51<210>5<211>51<212>dna<213>人工序列<400>5aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctattcgtcggcagcgtc51<210>6<211>51<212>dna<213>人工序列<400>6aatgatacggcgaccaccgagatctacactatcctcttcgtcggcagcgtc51<210>7<211>51<212>dna<213>人工序列<400>7aatgatacggcgaccaccgagatctacacagagtagatcgtcggcagcgtc51<210>8<211>51<212>dna<213>人工序列<400>8aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtaaggagtcgtcggcagcgtc51<210>9<211>51<212>dna<213>人工序列<400>9aatgatacggcgaccaccgagatctacacactgcatatcgtcggcagcgtc51<210>10<211>51<212>dna<213>人工序列<400>10aatgatacggcgaccaccgagatctacacaaggagtatcgtcggcagcgtc51<210>11<211>51<212>dna<213>人工序列<400>11aatgatacggcgaccaccgagatctacacctaagccttcgtcggcagcgtc51<210>12<211>51<212>dna<213>人工序列<400>12aatgatacggcgaccaccgagatctacacctagcgcttcgtcggcagcgtc51<210>13<211>51<212>dna<213>人工序列<400>13aatgatacggcgaccaccgagatctacacctcacaggtcgtcggcagcgtc51<210>14<211>51<212>dna<213>人工序列<400>14aatgatacggcgaccaccgagatctacaccttagttgtcgtcggcagcgtc51<210>15<211>51<212>dna<213>人工序列<400>15aatgatacggcgaccaccgagatctacaccttcctattcgtcggcagcgtc51<210>16<211>51<212>dna<213>人工序列<400>16aatgatacggcgaccaccgagatctacaccttgtagttcgtcggcagcgtc51<210>17<211>51<212>dna<213>人工序列<400>17aatgatacggcgaccaccgagatctacacgaaccatctcgtcggcagcgtc51<210>18<211>51<212>dna<213>人工序列<400>18aatgatacggcgaccaccgagatctacacgaatgtggtcgtcggcagcgtc51<210>19<211>51<212>dna<213>人工序列<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacacgaccaagatcgtcggcagcgtc51<210>20<211>51<212>dna<213>人工序列<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacgatcctcgtcgtcggcagcgtc51<210>21<211>51<212>dna<213>人工序列<400>21aatgatacggcgaccaccgagatctacacgatggacttcgtcggcagcgtc51<210>22<211>51<212>dna<213>人工序列<400>22aatgatacggcgaccaccgagatctacacgattagtgtcgtcggcagcgtc51<210>23<211>51<212>dna<213>人工序列<400>23aatgatacggcgaccaccgagatctacacgcgccttatcgtcggcagcgtc51<210>24<211>51<212>dna<213>人工序列<400>24aatgatacggcgaccaccgagatctacacggaacagttcgtcggcagcgtc51<210>25<211>51<212>dna<213>人工序列<400>25aatgatacggcgaccaccgagatctacacggaggaagtcgtcggcagcgtc51<210>26<211>51<212>dna<213>人工序列<400>26aatgatacggcgaccaccgagatctacacggagtcgctcgtcggcagcgtc51<210>27<211>51<212>dna<213>人工序列<400>27aatgatacggcgaccaccgagatctacacggcctgtatcgtcggcagcgtc51<210>28<211>51<212>dna<213>人工序列<400>28aatgatacggcgaccaccgagatctacacggcttaactcgtcggcagcgtc51<210>29<211>51<212>dna<213>人工序列<400>29aatgatacggcgaccaccgagatctacacggtaattatcgtcggcagcgtc51<210>30<211>51<212>dna<213>人工序列<400>30aatgatacggcgaccaccgagatctacacggtgttattcgtcggcagcgtc51<210>31<211>51<212>dna<213>人工序列<400>31aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtcctacgtcgtcggcagcgtc51<210>32<211>51<212>dna<213>人工序列<400>32aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtcgagagtcgtcggcagcgtc51<210>33<211>51<212>dna<213>人工序列<400>33aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtgcgtagtcgtcggcagcgtc51<210>34<211>47<212>dna<213>人工序列<400>34caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtctcgtgggctcgg47<210>35<211>47<212>dna<213>人工序列<400>35caagcagaagacggcatacgagataatccgaagtctcgtgggctcgg47<210>36<211>47<212>dna<213>人工序列<400>36caagcagaagacggcatacgagataatgatgagtctcgtgggctcgg47<210>37<211>47<212>dna<213>人工序列<400>37caagcagaagacggcatacgagatacaagcctgtctcgtgggctcgg47<210>38<211>47<212>dna<213>人工序列<400>38caagcagaagacggcatacgagatacaggagcgtctcgtgggctcgg47<210>39<211>47<212>dna<213>人工序列<400>39caagcagaagacggcatacgagataccgagctgtctcgtgggctcgg47<210>40<211>47<212>dna<213>人工序列<400>40caagcagaagacggcatacgagatacctgttggtctcgtgggctcgg47<210>41<211>47<212>dna<213>人工序列<400>41caagcagaagacggcatacgagataccttgaagtctcgtgggctcgg47<210>42<211>47<212>dna<213>人工序列<400>42caagcagaagacggcatacgagatacgttagggtctcgtgggctcgg47<210>43<211>47<212>dna<213>人工序列<400>43caagcagaagacggcatacgagatactacgtggtctcgtgggctcgg47<210>44<211>47<212>dna<213>人工序列<400>44caagcagaagacggcatacgagatactcttacgtctcgtgggctcgg47<210>45<211>47<212>dna<213>人工序列<400>45caagcagaagacggcatacgagatagaaggtagtctcgtgggctcgg47<210>46<211>47<212>dna<213>人工序列<400>46caagcagaagacggcatacgagatagagacttgtctcgtgggctcgg47<210>47<211>47<212>dna<213>人工序列<400>47caagcagaagacggcatacgagatagatctctgtctcgtgggctcgg47<210>48<211>47<212>dna<213>人工序列<400>48caagcagaagacggcatacgagatagcgctgggtctcgtgggctcgg47<210>49<211>47<212>dna<213>人工序列<400>49caagcagaagacggcatacgagataggttcatgtctcgtgggctcgg47<210>50<211>47<212>dna<213>人工序列<400>50caagcagaagacggcatacgagatagtctggtgtctcgtgggctcgg47<210>51<211>47<212>dna<213>人工序列<400>51caagcagaagacggcatacgagatagttataggtctcgtgggctcgg47<210>52<211>47<212>dna<213>人工序列<400>52caagcagaagacggcatacgagatagttccgcgtctcgtgggctcgg47<210>53<211>47<212>dna<213>人工序列<400>53caagcagaagacggcatacgagatataactaggtctcgtgggctcgg47<210>54<211>47<212>dna<213>人工序列<400>54caagcagaagacggcatacgagatatataagagtctcgtgggctcgg47<210>55<211>47<212>dna<213>人工序列<400>55caagcagaagacggcatacgagatatcgattcgtctcgtgggctcgg47<2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