利用分子标记辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用ssr分子标记辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的方法。

背景技术：

水稻是全球约50％人口的主要粮食之一，是人们日常碳水化合物、蛋白质、维生素等的主要来源。人口的增加，耕地的减少，种植结构的改变，劳动力、水源等的匮乏将造成全球粮食危机。高产、低成本、优质水稻是当前主要育种目标，其中草害是影响产量的主要因素之一，杂草不仅与作物争夺水分光照等、同时寄生病虫害，影响作物生长发育，降低作物产量、品质，影响收获效率，进而造成巨大经济损失。使用除草剂及种植抗除草剂水稻是目前最为有效的解决杂草问题的手段。

目前最受青睐的为用常规育种手段获得的抗咪唑啉酮类除草剂作物，商业化的抗咪唑啉酮类除草剂作物主要有水稻、玉米、油菜、小麦、向日葵(siyuantanrre,etal.,pestmanagsci,2010,61(3):246-257)。咪唑啉酮类除草剂由美国氰胺公司开发，已有6个商品化品种，包括咪唑烟酯、咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪草酸，这是一类广谱性除草剂、活性高、杀草谱广、用量少、对哺乳动物低毒，该类除草剂通过抑制靶标酶乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，als)，影响植物体内支链氨基酸合成，进而影响植物生长(powlessb,etal.,annurevplantbiol,2010,61:317-347)。抗除草剂作物通过als基因的突变，影响除草剂的结合，同时正常发挥功能而具有抗除草剂的能力，主要商业化的抗咪唑啉酮作物由ala205、trp574、ser653的一个或几个位点突变获得(tans,etal.,pestmanagsci,2005,61(3):246-257)。此外非靶标酶如脱毒酶(细胞色素p450单加氧酶)等也能使作物抗除草剂(saikah,etal.,plantphysiol,2014,166(3):1232-1240)。生产上以种植抗咪唑啉酮作物，并使用咪唑啉酮除草剂来防治杂草，该方式被称为clearfield生产体系，能高效经济地防除杂草，是农业生产中农民最为喜爱的种植模式，clearfield水稻品种包括了cl121、cl141、cl161和clxl8(siyuantanrre,etal.,pestmanagsci,2010,61(3):246-257)。

咪草烟是咪唑乙烟酸家族成员，可播前混土处理，也可苗前、出苗后、及插秧后处理，可作用于水稻整个生育期。选育获得的抗咪草烟水稻包括xl729、xl745、xp756、xp534等，美国通过推广抗除草剂咪草烟水稻获得巨大收益，至2011年抗咪草烟水稻及其杂交稻已占美国水稻的50％(肖国樱等，农业生物技术学报,2015,23(1):1-11)。

抗性作物的培育和推广可明显提高农田除草效率，降低除草费用，获得巨大经济效益，扩大除草剂使用范围及延长其使用时间等，因此本发明基于该目的，利用分子标记辅助育种选育抗除草剂咪草烟水稻品种。该方式与传统表型选择相比，结果可靠，能精确跟踪目标性状，减少育种的盲目性，选择过程不受环境及人为因素影响；减少田间工作，节约育种成本；可在早世代进行目标性状的选择，节约时间，缩短育种周期，加快抗除草剂咪草烟育种进程。

基于以上因素，本发明人从现有水稻品种资源材料中筛选抗咪草烟的水稻材料。对筛选得到的抗咪草烟水稻品种进行遗传分析，获得连锁标记，利用得到的标记进行分子标记辅助育种，提出利用连锁标记培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的育种方法。

技术实现要素：

技术问题

本发明的一个目的是提供用于辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的pcr引物及pcr试剂组；

在本发明中pcr试剂组由与粳稻抗除草剂咪草烟紧密连锁的ssr分子标记rm7413、dntp、dna聚合酶和pcr缓冲液组成。

本发明的另一目的是利用上述pcr试剂组在辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种中的应用。

本发明的又一目的是提供一种辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的方法。

技术方案：

利用分子标记辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的方法，包括如下步骤：

1)将抗除草剂咪草烟粳稻品种金粳818作为供体，常规粳稻品种作为受体，进行杂交育种，得到f1；

2)f1代群体自交获得f2代群体，利用ssr分子标记rm7413选择与供体金粳818抗除草剂基因连锁的分子标记带型一致的个体，即纯合基因型的f2代株系；

3)f2代-f6代群体自交至f7代群体，获得的f7代群体即为具有稳定抗除草剂咪草烟的粳稻新品种；

所述ssr分子标记rm7413分子鉴定方法为：

ssr标记rm7413扩增上游引物:gtctggttggcagctctctc

ssr标记rm7413扩增下游引物:cgacacacatccacgcac

利用ssr分子标记rm7413对待鉴定群体单株进行pcr扩增，检测pcr扩增产物，选择pcr产物与抗性亲本带型完全一致的植株，摒弃pcr产物与感性亲本带型一致或同时含有两亲本带型的植株，所筛选获得的粳稻植株即为纯合的具有抗除草剂咪草烟性状的植株。

所述的方法中f2代-f6代群体自交至f7代群体，每代选择综合农艺性状优良的单株。

其特征还在于，抗除草剂表型鉴定方法包括如下步骤：粳稻种子浸种发芽，田间常规播种，至幼苗长至2叶1心时，利用咪草烟推荐使用浓度70gaiha^-1喷洒筛选，2周后鉴定表型，未死亡的植株即为稳定的抗除草剂咪草烟单株。

其中ssr分子标记rm7413所检测pcr扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；所述pcr扩增的模板为基因组dna。

有益效果

本发明人从7403份水稻品种资源材料中筛选到一个抗咪草烟的水稻材料“金粳818”。经鉴定发现推广品种金粳818对除草剂咪草烟具有抗性，但其遗传机理不明，因此首先对该品种的遗传机理进行研究，并进行抗性基因定位。

本发明的实验证明，本发明筛选获得一对与抗咪草烟基因紧密连锁的ssr分子标记rm7413，该标记在选育抗除草剂咪草烟粳稻品种中，能够弥补传统育种方法的不足，能够精确并简化选育抗除草剂咪草烟粳稻品种的过程。本发明获得的ssr分子标记rm7413和分子标记辅助选育方法将在粳稻抗除草剂咪草烟中发挥重要作用。

附图说明

图1亲本金粳818、苏垦118和f2群体中除草剂咪草烟抗性及感性苗表型。

注：r表示抗性苗；s表示敏感苗。

图2ssr标记rm7326、rm7413、rm7426、rm5221在敏感植株中的基因型(部分图)。

注：1表示抗性对照金粳818；2表示敏感对照苏垦118；m表示dnamarker；箭头指示交换单株即杂合带型。

图3基因在染色体上与ssr标记的相对位置

图4ssr标记rm7413在f7代的随机10个个体中的基因型。

注：1表示抗性对照金粳818；2表示敏感对照南粳9108；m表示marker；3-12：10个随机个体的基因型。

图5ssr标记rm7413在常规粳稻中的基因型(部分图)。

注：1表示抗性对照金粳818；2表示敏感对照苏垦118；m表示marker；其余为常规粳稻品种。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂、品种等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

引物合成由南京擎科生物技术有限公司完成，以下实施例中所用到的供体亲本为抗除草剂咪草烟的粳稻品种金粳818，受体亲本为常规粳稻品种苏垦118和南粳9108。

实施例1、与粳稻抗除草剂咪草烟性状连锁的ssr分子标记rm7413的获得

本发明课题组从7403份水稻品种资源材料中筛选到一个抗咪草烟的水稻材料“金粳818”。经鉴定发现品种金粳818对除草剂咪草烟具有抗性，但其遗传机理不明，因此首先对该品种的遗传机理进行研究，并进行抗性基因定位。

1)金粳818抗除草剂咪草烟特性的遗传分析

以抗除草剂咪草烟的粳稻品种金粳818为供体，以对除草剂咪草烟敏感的推广粳稻品种苏垦118为受体进行杂交，获得f1植株10株，至f1代幼苗长至2叶1心时，利用咪草烟推荐使用浓度70gaiha^-1喷洒筛选，结果显示获得的f1代植株全部存活，表明杂种f1抗除草剂咪草烟。

将f1代植株自交获得f2代，f2代幼苗长至2叶1心时，利用咪草烟推荐使用浓度70gaiha^-1喷洒筛选，2周后观察表型。结果表明，580株f2植株中，抗性苗能够正常生长，共有430株，敏感苗立即枯萎死亡，共有150株，抗感符合3:1理论分离比例(χ²＝0.1862＜χ²0.05,1＝3.84)，其表型特征见图1，抗性植株在喷洒除草剂咪草烟后，未出现变黄枯萎现象，而敏感苗则表现为叶片变黄并逐渐枯萎，最终死亡。以上结果说明金粳818抗咪草烟性状为显性性状，感咪草烟性状为隐性性状，并由一对显性核基因控制。

2)抗咪草烟基因定位及其连锁ssr标记的筛选

从f2群体中，随机选取抗性苗5株，敏感苗5株，取叶片，利用ctab法提取基因组dna。同时提取两亲本dna作为对照组。取抗、感单株dna分别混合建立抗、感池，采用分群法筛选多态性ssr分子标记。随机选择500对均匀分布于水稻12对染色体上的ssr分子标记，利用500对标记对抗除草剂咪草烟基因池和感咪草烟基因池进行pcr扩增，同时扩增两亲本基因组dna，

按照以下组分顺序配制pcr反应液(20ul体系，鼎国，2×taqpcrgreenmix)：

按照以下程序进行pcr反应：

pcr产物于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。选择在样本中主条带清晰、多态性明显，重复性好的ssr分子标记，本发明共获得4对能够清楚分辨不同基因型的分子标记，分别是rm7326、rm7413、rm7426、rm5221，4个ssr分子标记能够明确区分2种亲本基因型及杂合基因型。4对引物都位于水稻2号染色体。

以100株f2群体中的敏感致死的隐性单株作为作图群体，利用上述筛选到的4个标记对作图群体单株进行基因型分析，pcr扩增反应体系、程序及检测方法同上。结果证明4个标记都有一定的偏分离(图2)，rm7326、rm7413、rm7426、rm5221在100株隐性植株中分别有交换株25、10、14、16株，rm7413检测获得的交换株最少，rm5221最多，确定金粳818中抗除草剂咪草烟基因位于2号染色体rm7413至rm7426之间，并且rm7413与抗性基因距离最近(图3)。连锁标记rm7413可用于辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种。

实施例2、分子标记在辅助选育抗咪草烟粳稻品种中的应用

1)本发明使用抗咪草烟品种金粳818为供体亲本，对咪草烟敏感的南粳9108为受体亲本，两亲本都是目前主要推广品种，具有良好的丰产性和适应性。将两亲本杂交组配，收获f1代种子。

2)f1代植株自交获得f2代种子，种植f2种子50粒，得到f2代植株。每个单株取叶片，提取dna，用实施例1中的ssr标记rm7413进行扩增，扩增体系、条件及检测方法同实施例1中所示。选择与抗性亲本带型完全一致的单株。

3)将f2代选择的植株连续自交至f7代，同时每代选择综合农艺性状优良的植株。f7代时进行表型鉴定，于幼苗长至2叶1心时，用咪草烟推荐使用浓度70gaiha^-1喷洒，2周后观察表型，f7植株全部存活且生长良好，随机选取10株苗，取叶片，利用标记rm7413鉴定，所有植株均呈现与抗性亲本金粳818完全一致的带型(图4)。实施例2证明ssr分子标记rm7413能够用于辅助选育抗咪草烟粳稻品种，与传统育种相比，大大简化育种过程。

实施例3、与粳稻抗除草剂咪草烟连锁的标记rm7413在当前主要推广的粳稻品种中的应用潜力

常规粳稻品种通常不具有抗除草剂咪草烟的能力，若标记rm7413在除草剂敏感的常规粳稻品种及抗性品种金粳818中存在实施例1、2中的多态，则rm7413可用于常规粳稻的除草剂抗性改良，以获得抗除草剂新品种。本发明选取了长江中下游主要推广的91个粳稻品种进行多态性鉴定，用实施例1、2中的ssr标记rm7413进行扩增，扩增体系、条件及检测方法同实施例1中所示。鉴定品种包括连粳4号、连粳7号、连粳9号、连粳10号、连粳11号、华粳3号、华粳4号、华粳5号、华粳6号、华粳7号、淮稻5号、淮稻7号、淮稻8号、淮稻9号、淮稻10号、淮稻11号、淮糯11号、淮稻13号、淮优粳2号、淮粳096、淮香稻15号、盐稻8号、盐稻9号、盐稻11号、盐粳9号、盐粳10号、盐粳11号、扬育粳2号、扬中稻1号、扬辐粳1号、扬辐粳8号、扬粳4308、扬粳4227、扬糯19号、宁粳1号、宁粳2号、宁粳3号、宁粳4号、宁粳5号、南粳49、南粳40、南粳41、南粳42、南粳44、南粳45、南粳46、南粳47、南粳5055、通粳981、武粳4号、武粳13号、武粳15号、武育粳3号、武香粳9号、武香粳14号、武育粳18号、武运粳7号、武运粳11号、武运粳19号、武运粳21号、武运粳23号、武运粳24号、武运粳27号、武运粳29号、武陵粳1号、常农粳3号、常农粳4号、常农粳5号、常农粳6号、常农粳7号、常粳144、苏沪香粳、苏粳8号、苏香粳2号、苏粳5号、苏粳9号、镇稻1号、镇稻7号、镇稻10号、镇稻12号、镇稻13号、镇稻15号、镇稻16号、镇稻17号、镇稻18号、镇稻88、镇稻99、镇稻9424、泗稻12号、华瑞稻1号、徐稻3号。鉴定结果如图5所示：以抗除草剂咪草烟金粳818为抗性对照，以除草剂敏感品种苏垦118为感性对照，选取的91个推广品种带型均与金粳818不同，与敏感品种苏垦118带型一致，结果表明与抗咪草烟连锁的分子标记rm7413在91个常规粳稻品种中均与供体金粳818存在多态性，因此可利用分子标记rm7413用于长江中下游主要推广的粳稻品种抗除草剂咪草烟育种。

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<110>江苏省农业科学院

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