一种复合菌剂及其在降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的用途的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种复合菌剂及其在降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的用途。
背景技术：
：拟除虫菊酯农药是国内代替有机氯农药和其它剧毒长残留杀虫剂的主要农药类型之一。其品种和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位。由于第二代以后的拟除虫菊酯农药的特点是光、热的分解，自然环境中的拟除虫菊酯残留主要由微生物的活动来去除，所以国外工作者已筛得些能降解拟除虫菊酯的菌株并进一步研究了农药的降解机理。而在国内，主要侧重于研究拟除菊酯的环境行为和残留消解动态的工作。拟除虫菊酯类农药都含有多个苯环结构，具有中等的生毒性。降低农药残留的途径有多种，包括禁用(限用)某种农药、化学处理和微生物降解等方式。拟除虫菊酯类农药作为目前最有发展前景的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。大量研究表明，微生物对土壤和水环境中的农药降解起着关键作用，如假单胞菌属、肠杆菌属、产碱杆菌属和芽孢杆菌属等对拟除虫菊酯类农药具有很好的降解作用。在土壤、水体等自然环境中，对残留农药的降解往往是多种微生物共同作用的结果，但以往的研究大多针对单一菌对单一农药的降解，而针对混合菌同时降解多种拟除虫菊酯类农药的报道较少。丁海涛，土壤学报2003年，公开了一株地衣芽孢杆菌，其对菊酯的降解率仅为50%左右，降解时间为5天。在降解污染物时，不同微生物之间可存在协同作用，因此混合菌的降解效果往往比单一菌要好，降解时间更短。开发一种配伍合理，共生不拮抗的复合菌剂是我们需要解决的技术问题。技术实现要素：为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供用于一种复合菌剂及其在降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的用途。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：一种复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：步骤1）制备驯化培养基，步骤2）菌株驯化，步骤3）制备载体，步骤4）搅拌、干燥以及包装。具体地，所述复合菌剂按照如下步骤制备而得：步骤1）制备驯化培养基：取氰戊菊酯100mg，葡萄糖50g，农作物秸秆粉40g，豆粕20g，k2hpo42g，kh2po42g，mgso40.5g，mnso40.2g，feso40.1g，添加到水中，调ph为6.8，定容至1l，即得；步骤2）菌株驯化：将鞘氨醇单胞菌种子液按照5%的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6-9h；然后将地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液以及藤黄微球菌种子液按照3-5:2-3:2-3的体积比混合，再按照6%的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6-9h，然后添加氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液按照8%的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12-18h，得到复合菌液；步骤3）制备载体：将农作物秸秆粉、锯末以及豆粕按照2-3:2-3:1-2的质量比混合搅拌均匀得到载体；步骤4）搅拌、干燥以及包装：将复合菌液添加到2-3重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为15-20℃，干燥后含水量为6-10wt％，包装，即得。优选地，所述鞘氨醇单胞菌种子液、地衣芽孢杆菌种子液、沼泽红假单胞菌种子液、藤黄微球菌种子液以及阴沟肠杆菌种子液的浓度均为1×108个/ml。优选地，所述农作物秸秆粉为玉米秸秆粉、小麦秸秆粉或二者的混合物。优选地，所述步骤2）中，氰戊菊酯的添加量为0.02wt%。优选地，所述鞘氨醇单胞菌为cgmccno.4589，所述地衣芽孢杆菌为atcc14580，所述沼泽红假单胞菌为atcc17001，所述藤黄微球菌为atcc49442，所述阴沟肠杆菌为atcc700323。本发明还要求保护所述复合菌剂在降解土壤中拟除虫菊酯类农药残留的用途。优选地，所述拟除虫菊酯类农药的浓度大于100mg/kg土壤。进一步地，上述只是本发明的优选方案。作为次优选的技术方案，本发明对加入的发种子液中菌株的数量也没有特别的限制，这可以根据所述环境需要来决定。本发明所述的菌种属于已知菌株，均可以从cgmcc、atcc等商业途径购买得到。本发明的各菌种的种子培养和发酵罐培养为本领域的常规培养方式，不是本发明创新点，此处不详述。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：利用菌株降解拟除虫菊酯类农药残留的寄主专化性既是它的一个优点，同时也是其主要缺陷，单一微生物制剂的专化性特性，使其很难对所有农田进行有效防除，从而就限制复合菌剂推广应用；而且一般采用单一菌株降解速度较慢，需要一周以上的处理时间才能发挥一定的降解效果，利用多个菌株混合开发出复合菌剂是解决过于单一缺陷的有效途径。本发明复合菌剂中各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，活性高，能够有效地处理土壤中拟除虫菊酯类农药残留；本发明利用复合菌剂的修复方法操作简单易行，显著降低了用药量、施药次数以及用药成本，成本低，环保无污染，应用前景广阔；本发明菌株首先经过驯化培养，使其能够更快速适应环境，提高了降解菊酯类农药的效率；按照菌株适应农药的不同能力进行培养，其中，阴沟肠杆菌降解能力最强，可直接采用高浓度的农药进行驯化；在制备驯化培养基时采用农作物秸秆作为原料，以及在制备载体时使用了大量农业废弃物，不仅增强菌株的存活时间及在土壤中的定植能力，对农药也有一定的吸附性，节省了成本，并且还可作为有机质来来改良土壤。本发明复合菌剂可降解高浓度的菊酯类农药残留，降解速度快，96h之内基本实现了完全降解，应用前景广阔。附图说明图1：复合菌剂对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯含量为100mg/kg的土壤样品的处理；图2：复合菌剂对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯含量为200mg/kg的土壤样品的处理。图3：复合菌剂对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯含量为400mg/kg的土壤样品的处理。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1一种复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：取氰戊菊酯100mg，葡萄糖50g，农作物秸秆粉40g，豆粕20g，k2hpo42g，kh2po42g，mgso40.5g，mnso40.2g，feso40.1g，添加到水中，调ph为6.8，定容至1l制得驯化培养基；将鞘氨醇单胞菌种子液（1×108个/ml）按照5%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照3:2:2的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养6h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照8%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养12h，得到复合菌液；将农作物秸秆粉、锯末以及豆粕按照2:2:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；将复合菌液添加到2重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为6wt％，包装，即得。所述鞘氨醇单胞菌为cgmccno.4589，所述地衣芽孢杆菌为atcc14580，所述沼泽红假单胞菌为atcc17001，所述藤黄微球菌为atcc49442，所述阴沟肠杆菌为atcc700323。实施例2一种复合菌剂，其按照如下步骤制备而得：取氰戊菊酯100mg，葡萄糖50g，农作物秸秆粉40g，豆粕20g，k2hpo42g，kh2po42g，mgso40.5g，mnso40.2g，feso40.1g，添加到水中，调ph为6.8，定容至1l，制得驯化培养基；将鞘氨醇单胞菌种子液（1×108个/ml）按照5%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养9h；然后将地衣芽孢杆菌种子液（1×108个/ml）、沼泽红假单胞菌种子液（1×108个/ml）以及藤黄微球菌种子液（1×108个/ml）按照5:3:3的体积比混合，再按照6%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养9h，然后添加0.02wt%的氰戊菊酯；最后将阴沟肠杆菌种子液（1×108个/ml）按照8%（体积比）的接种量转到驯化培养基中，30℃培养18h，得到复合菌液；将农作物秸秆粉、锯末以及豆粕按照3:3:2的质量比混合搅拌均匀得到载体；将复合菌液添加到3重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为15℃，干燥后含水量为8wt％，包装，即得。所述鞘氨醇单胞菌为cgmccno.4589，所述地衣芽孢杆菌为atcc14580，所述沼泽红假单胞菌为atcc17001，所述藤黄微球菌为atcc49442，所述阴沟肠杆菌为atcc700323。实施例3土壤中拟除虫菊酯类农药残留的降解试验：样品选择：样品1：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为100mg/kg；样品2：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为200mg/kg；样品3：联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为400mg/kg。操作流程：以实施例1为例，将复合菌剂100g加入到土壤样品1000kg中，搅拌均匀，保证含水量为20-30％左右。分别检测12h、24h、48h、72h以及96h的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量。图1可见，复合菌剂对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解效果差异不大，24h降解率可达到35%以上，96h基本降解完毕；由图2-3可见，复合菌剂高浓度的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯72h降解率可达到90%左右；结合图1-3，本发明复合菌剂可降解高浓度的菊酯类农药残留，降解速度快，96h之内基本实现了完全降解。实施例4本发明复合菌剂中各菌株的配伍协同效果测试：选择土壤样本联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的含量均为200mg/kg；复合菌剂组分别为实施例2组，对照组1（不添加鞘氨醇单胞菌，其他同实施例2），对照组2（不添加地衣芽孢杆菌，其他同实施例2），对照组3（不添加沼泽红假单胞菌，其他同实施例2），对照组4（不添加藤黄微球菌，其他同实施例2）；对照组5（不添加阴沟肠杆菌，其他同实施例2）；操作流程同实施例3，检测时间点选择第72h；具体结果见表1：表1组别实施例2组对照组1对照组2对照组3对照组4对照组5联苯菊酯20.736.747.135.440.258.9甲氰菊酯17.341.535.943.851.953.7氯氰菊酯22.944.831.651.047.667.4结论：本发明复合菌剂中各菌株相互协同，配伍合理，对菊酯类农药残留具备较好的降解效果，应用前景广阔。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页12