本发明属于dna传感器技术领域，具体涉及一种基于g-四链体的dna探针在dna序列检测中的应用。
背景技术：
众所周知，dna作为遗传信息的载体，在人和动物的生命活动中扮演着至关重要的角色。现如今，对特殊序列dna的检测在诸多方面都发挥着重要的作用，如环境监测、食品安全分析、案件侦探、遗传疾病的治疗和临床诊断等。正因为对dna的检测有巨大的潜在应用价值，所以，开发出具有灵敏度高、特异性强的检测方法势在必行。为了满足这样的需求，研究人员进行了大量的探索并开发出了一系列基于不同原理的检测方法，如电化学（electrochemistry）、表面等离子体共振（surfaceplasmonresonance）、荧光共振能量转移（fret）、链置换（stranddisplacement）、磷光能量转移（pet）、光致电子转移等。但是，这些已报道的传感器都有较高的检测成本和复杂的操作程序，而生物传感器的产生引起了人们的广泛关注。
近年来，核酸内切酶的应用促进了信号放大检测方法的发展，但不幸的是，这种方法面临着普遍的局限性——它要求目标dna必须含有一个特殊的序列以供内切酶识别，因此限制了这种方法的普及和应用。而外切酶不像内切酶，它不需要特殊的识别序列，可以选择性地从3’-端开始将处于双链结构的dna序列解除掉，而对悬挂的3’-端和非双链结构的dna没有任何损伤作用。但是，这种方法多次用到的核酸酶将会导致检测成本大大提高，此外，还需要进行复杂的设计过程，因此也限制了它的推广应用。
而willner等人设计了一种基于镁基dna酶的检测方法，虽然这种平台不需要上述基于蛋白质的生物酶，但是它的制作成本也比较高，而且容易受到核糖核酸酶和化学试剂的降解作用。而本文设计了一种非常简单的检测方案，它不需要对dna进行额外的修饰，也没有相对复杂的设计过程，而且具有非常有效的可操作性和廉价的检测成本。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于g-四链体的dna探针在dna序列检测中的应用，基于目标dna诱导探针dna向g-四链体结构变化而产生荧光信号的变化，实现了以“turn-on”模式对特定dna序列的检测。此方法非常简单，不需要荧光修饰，也没有相对复杂的设计过程，而且具有非常有效的可操作性和廉价的检测成本。
本发明采用的技术方案是一种基于g-四链体的dna探针在dna序列检测中的应用，包括以下步骤：①首先配制a、b、c、d、e五组含有探针dna的混合液；含有探针dna的混合液包括50mmph7.4的tris-hcl缓冲溶液，100mm的kcl，10mm的mgcl2，1μm探针dna，5-2000nmxdna；在95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温（25℃）；
其中，a组的xdna为目标dna，b组的xdna为目标dna替换一个碱基、c组的xdna为目标dna替换两个碱基、d组的xdna为目标dna替换三个碱基、e组的xdna为待测dna；
②向不同组含有探针dna的混合液中加入1ml1μmppix溶液，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱，激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值；ppix的结构式如下：
③将e组的荧光强度值与a、b、c、d组进行比较。
所述探针dna的序列如seqidno.1所示，所述目标dna的序列如seqidno.2所示。
所述步骤①b、c、d组含有探针dna的混合液中xdna的序列分别如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5所示。
本发明所用探针dna（p-dna）序列是基于ps2.m（5’-gtg3tag3cg3t2g2-3’）进行增长设计的，选择原卟啉（ppix）作为它的配体。ps2.m是一种富g的dna序列，它可以在k+的诱导下折叠形成平行的g-四链体结构；而ppix（图1）是一种阳离子卟啉，可以特异性地与平行结构的g-四链体结合，从而使其荧光强度得到大大增强。
本发明的检测机理如图2所示。首先我们设计了一个发卡结构的dna探针
（5’-acccactttttcgtttccgtgggtagggcgggttgg-3’），加粗画线部分是互补配对序列，它由三个部分组成：互补区（6个碱基的茎部）、识别区（12个碱基的环状区）和富g区。其中互补区可以与富g区的部分序列互补配对，从而形成环状的发卡结构，锁定部分富g序列，使其在k+存在的条件下也不能够形成g-四链体。而此时ppix也不能够与双链dna或者单链dna结合，只能表现出非常微弱的荧光。当加入目标dna（t-dna）后，它可以与识别区互补配对生成稳定性更强的双链结构，打开稳定性较弱的发卡结构，从而释放出富g序列，在k+的作用下折叠形成g-四链体结构并与ppix结合而发出很强的荧光信号。这种荧光信号的强度随着目标dna浓度的增加会逐渐增强，因此可以达到检测目标dna的目的。
在本发明中，我们考察了ppix浓度对检测体系的影响，结果如图3所示。我们以cdna:cppix的值作为参考，当两者之间的比值为3即dna浓度为ppix的3倍时，加入目标dna后的荧光强度较弱，说明g-四链体并没有与足够的ppix结合；当比值为2时，其荧光强度也没有达到最大值，直到两者的比值为1即dna浓度与ppix相等时，其荧光强度达到了最大值，此时再增加ppix的浓度即当两者浓度比达到1:2时，其荧光强度也并没有明显增强，说明g-四链体与ppix是1:1结合的。
为了检验实验设计的可靠性，我们进行了dna的特异性检测实验。设计了三条碱基错配dna,序列分别为1碱基错配dna(5’-ggaaaggaaaaa-3’)，2碱基错配dna(5’-ggaaaggaataa-3’),3碱基错配dna(5’-gcaaaggaataa-3’)。在相同的优化条件下，我们分别加入1μm的目标dna、1碱基错配的dna、2碱基错配的dna和3碱基错配的dna（其中错配的位置和碱基序列已在表1中列出），经孵育后对体系荧光进行检测。结果如图7所示，随着错配碱基数量的增加，荧光强度依次降低。因为在碱基互补配对中，如果有一个或多个碱基发生突变，就会不同程度地影响双链结构的稳定性，得到的荧光强度会有所不同。从图中我们可以很清楚地看出，即便是一个碱基的错配，这样的传感器也能很好地分辨出来，这就说明本实验所设计的传感器具有良好的选择性和识别能力。
本发明中所涉及的dna均可由本领域常规技术合成，具体由上海生工有限公司合成。
本发明与现有技术相比具有以下显著优点：首先，这个传感器没有复杂的修饰过程；其次，相对于其它有酶参与的传感器来说，虽然在检测限方面有较大差异，但是相比之下设计简单，能够免于复杂的操作，也不用严格控制实验条件来保持酶的活性；而最大的特点在于相当的经济实用。
附图说明
图1当检测体系中加入目标dna(5’-ggaaacgaaaaa-3’)、1碱基错配的dna（5’-ggaaaggaaaaa-3’）、2碱基错配的dna（5’-ggaaaggaataa-3’）和3碱基错配的dna（5’-gcaaaggaataa-3’）时的荧光光谱；
图2基于g-四链体的dna传感器的原理示意图；
图3四种不同比值的cdna:cppix在目标dna存在时荧光强度变化；
图4探针dna（a）和探针dna+目标dna（b）的dsc图谱；
图5探针和探针+目标dna的圆二色光谱图；
图6（a）只存在ppix；（b）存在p-dna（探针dna）和ppix；（c）存在ppix，p-dna和t-dna（目标dna）时荧光强度的变化；
图7a.加入不同浓度目标dna后的荧光光谱图；b.在632nm处的荧光强度曲线图；c.dna检测的线性区间。
具体实施方式
实施例1
（1）于室温下称取tris，用去离子水溶解并用盐酸调节溶液ph值，配制成浓度为50mm的缓冲溶液，摇匀后放置于冰箱中在4℃下保存备用。依照上述步骤，我们分别配制了ph为6.0、6.5、7.0、7.4、7.6、8.0、8.5、9.0的缓冲溶液。
（2）称取kcl，用去离子水溶解并定容，配制成1m浓度；同理，用同样的方法配制0.5m的mgcl2溶液和50μm的ppix溶液。配好的溶液在4℃下保存，用时稀释至所需浓度。
（3）将所购dna（均购自于上海生工有限公司）产品保存在冷冻箱中，配制时取适量在高速冷冻离心机中于8000rpm下离心5分钟，之后加入ph7.4的tris-hcl缓冲溶液，剧烈摇晃5分钟将其完全溶解，并按照说明准确稀释至10μm，用时再稀释至所需浓度，dna溶液保存时间不超过7天。
（4）差示扫描量热（dsc）：将混合液（包括50mmph7.4的tris-hcl缓冲溶液，100mm的kcl，10mm的mgcl2，探针dna1μm，目标dna1μm，总体积为1ml）置于95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温。先将上述混合液在thermovac装置中进行脱气处理，之后向参比池中加入tris-hcl缓冲溶液，样品池中加入等量混合液，设置扫描温度范围20℃-90℃，升温速度60℃/分钟，扫描5次取最后一次数据。
为了证实加入目标dna前后探针dna在结构上确实发生了变化，我们利用dsc对样品进行了测试，结果如图4所示。依据dna结构的变化所吸收热量的不同，我们用差示扫描微量热仪对加入目标dna前后的结构变化所吸收的热量进行了测试。从两者间的对比来看，加入目标dna后的样品在结构变化过程中所吸收的热量要比单纯的探针dna要高，因为加入目标dna后它不仅形成了g-四链体结构还有一部分互补的序列，使其结构变得更加稳定。从dsc扫描的结果我们还得到了它们结构变化时的温度，前者为69.95℃（与模拟值68.3℃比较接近），而后者在90℃时几乎达到了一个平台，至少可以看出，其结构变化所需要的温度是明显高于69.95℃的。这样的结果也说明，加入目标dna前后探针dna的结构一定发生了变化，而且是向更稳定的结构转变的。
（5）圆二色光谱（cd）；将混合液（包括50mmol/lph7.4的tris-hcl缓冲溶液，50mmol/lkcl，10mmol/lmgcl2，0.5μmol/l探针dna，0.75μmol/l目标dna，样品体积均为1ml）在95℃的水浴中加热10分钟后缓慢冷却至室温（实验设定为25℃），之后加入1ml的1μm的ppix溶液，在暗处反应1h后，设定检测温度25℃，在chirascan圆二色光谱仪中用1cm的比色皿测定圆二色光谱图。扫描范围是230nm-320nm，时间间隔0.1ms，波长间隔1nm，扫描三次取平均值。
为了进一步说明结构发生了怎样的变化，我们进行了圆二色光谱的测试，如图5所示，典型的平行g-四链体结构在260nm附近有个正向的吸收峰，在240nm附近有个负向的吸收峰；而典型的反平行g-四链体结构在295nm附近有个正向的吸收峰，在265nm附近有个负向的吸收峰。从图5a可以看出，只有探针dna存在时，在280nm附近有个正向的吸收峰，在250nm附近有个负向的吸收峰，这也许能够说明探针dna没有形成g-四链体结构，可能处于发卡结构的状态。当我们加入目标dna后，从理论上讲发卡结构将被打开，从而形成g-四链体结构，而图5b也表明在260nm附近有个正向的吸收峰，在240nm附近有个负向的吸收峰，这就证实了平行g-四链体结构可以有效形成。
（6）荧光光谱：将混合液（包括浓度均为1μmol/l的探针dna、ppix和目标dna，100mmol/l的kcl，10mmol/l的mgcl2，体积为1ml）在95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温，加入1μm的ppix溶液，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱。激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值。
其次根据实验的设计，我们对原理进行了验证，结果如图6所示，当溶液中只存在ppix时（a曲线），其荧光强度十分微弱，而且它的荧光发射位置在620nm左右，与b曲线和c曲线明显不同。当溶液中同时存在探针dna（p-dna）和ppix时（图6b曲线），它的荧光发射位置出现在632nm左右，可能原因是有很少部分的探针dna没有形成发卡结构，导致有少量g-四链体结构的形成，但是其荧光强度是比较弱的。当加入目标dna（t-dna）后（图6c曲线），发卡结构完全打开，形成大量的g-四链体，与ppix结合后荧光强度明显增强。这样的结果表明，本实验的设计原理是完全可行的，可以达到检测目标dna的目的。
（7）灵敏度检测：将混合液（包括50mmph7.4tris-hcl缓冲溶液，50mmol/l的kcl，10mmol/l的mgcl2，1μmol/l的探针dna和不同浓度的目标dna，体积为1ml）在95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温，加入1ml1μm的ppix溶液，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱。激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值。
在经过优化的实验条件下，我们对目标dna进行了灵敏度检测，图7显示了检测结果。根据实验原理，当目标dna加入后，探针dna会折叠形成平行的g-四链体结构，与ppix结合后使其荧光强度增加，并且随着目标dna浓度的不断增加，荧光强度也会随之逐渐增强。在优化后的实验条件下，我们得到了当加入目标dna的浓度分别为0nm、5nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、70nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1500nm、2000nm时的荧光光谱（图7a）。当目标dna的浓度在5-200nm之间变化时，体系荧光强度急剧增加，随后在500-2000nm之间荧光强度的增加速率明显放缓，到2000nm时几乎趋于一个平台。因为当目标dna的浓度较小时，与探针dna结合的几率很大，能够有效形成g-四链体，而当目标dna浓度较大时，它们之间的竞争性增强，与探针dna结合速率放慢，导致在既定的测试时间内不能很好地表现出荧光增强的效果。我们发现，当目标dna的浓度在0-100nm之间时，体系荧光强度值有很好的线性关系，其相关系数r=0.99528（图7c）。在此区间内，即使加入5nm的目标dna时，检测体系也有可辨识的荧光增强的响应信号，经3倍信噪比计算得出此传感器的检测限为2.4nm，达到了很好地检测效果。
（8）特异性检测：将混合液（包括50mmph7.4tris-hcl缓冲溶液，50mmol/l的kcl，10mmol/l的mgcl2，1μmol/l的探针dna，1μmol/l目标dna,以及1μmol/l的错配dna，样品体积为1ml）在95℃的水浴中加热10分钟，之后缓慢冷却至室温，加入1μm的ppix溶液1ml，在暗处反应1h，最后用微量荧光比色皿在荧光光度计中测得其荧光光谱。激发波长设定为410nm，扫描范围为550nm-750nm，测定在632nm处的荧光强度值。
为了检验实验设计的可靠性，我们进行了dna的特异性检测实验。在相同的优化条件下，我们分别加入1μm的目标dna、1碱基错配的dna、2碱基错配的dna和3碱基错配的dna（其中错配的位置和碱基序列已在表1中列出），经孵育后对体系荧光进行检测。结果如图1所示，随着错配碱基数量的增加，荧光强度依次降低。因为在碱基互补配对中，如果有一个或多个碱基发生突变，就会不同程度地影响双链结构的稳定性，得到的荧光强度会有所不同。从图中我们可以很清楚地看出，即便是一个碱基的错配，这样的传感器也能很好地分辨出来，这就说明本实验所设计的传感器具有良好的选择性和识别能力。
表1本发明所用的dna名称、序列以及生产厂家
注：表1中探针dna一栏中加粗且带有下划线部分是互补配对序列，最后三栏中加粗且带有下划线的碱基序列代表的是错配的位置和碱基。
序列表
<110>河南师范大学
<120>一种基于g-四链体的dna探针在dna序列检测中的应用
<141>2017-10-27
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(1)
<400>1
acccactttttcgtttccgtgggtagggcgggttgg36
<210>2
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(2)
<400>2
ggaaacgaaaaa12
<210>3
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(3)
<400>3
ggaaaggaaaaa12
<210>4
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(4)
<400>4
ggaaaggaataa12
<210>5
<211>12
<212>dna
<213>人工序列(5)
<400>5
gcaaaggaataa12