本发明涉及发酵工程技术领域，更具体地说是涉及一种基于our为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法
背景技术：
葡萄糖氧化酶(简称god)是一种需氧脱氢酶，通常与过氧化氢酶联合发挥催化作用。有氧条件下，god能够专一性地催化氧化β-d葡萄糖生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，其中过氧化氢在过氧化氢酶的作用下分解生成水，葡萄糖酸内酯随后自发水解或在内酯酶的作用下水解成葡萄糖酸。god因其具有的氧化还原性，在食品、饲料、医药、生物等行业被广泛应用，具有广阔的应用前景。
现有技术中，葡萄糖氧化酶的大规模生产主要来自god基因的外源表达。巴斯德毕赤酵母作为一种成熟的外源蛋白表达系统，在无其它碳源存在的条件下，能以甲醇为唯一碳源生长产酶，并且受甲醇唯一调控，具有生长迅速、营养条件需求低、蛋白表达量高、副产物少等优点。但是毕赤酵母发酵过程属于高好氧发酵，当发酵液在高耗氧条件下，传统的溶氧电极度数几乎接近零点。在传统的甲醇诱导型毕赤酵母的发酵工艺中，甲醇补料速度是非常关键的，作为诱导过程中唯一的碳源和能源，甲醇的补料方式、浓度、诱导时间对外源蛋白的表达都会产生影响。在诱导阶段，除了要防止其浓度过高对细胞产生毒害作用，还要保证甲醇浓度能够提供毕赤酵母表达代谢所必需的碳源和能源，避免因过低浓度导致细胞持续饥饿，造成生物量和表达量都下降。然而甲醇过量与甲醇补料不足的表现十分相似，经验不足的情况下往往会判断错误，造成无可挽救的损失。
因此，如何提供一种能够正确反应毕赤酵母发酵用营养物质变化的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种基于our为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法。此种方法可以有效监测毕赤酵母发酵过程中营养物质的变化，从而减少不必要的经济损失。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于our为控制参数的葡萄糖氧化酶发酵方法，葡萄糖氧化酶发酵用菌种为将葡萄糖氧化酶基因转入野生型毕赤酵母体内得到的重组毕赤酵母，包括以下步骤：
1)菌种的富集培养：将重组的毕赤酵母依次接种于一级培养基和二级培养基中，进行菌种的富集；
2)将步骤1)所得发酵液置于灭菌后的发酵罐营养液中；
3)建立our反馈调控发酵机制，包括：
(1)批发酵：将步骤1)中的菌种接入步骤2)的发酵罐中，进行发酵。初始发酵时，通过控制种子浓度及搅拌转速和风量控制毕赤酵母耗氧速率为0.4-0.7molo2/l/h；经过3-4h的适应期后，毕赤酵母开始呈指数生长，our值随之缓慢呈平滑抛物线形式上升至35-45molo2/l/h，至发酵罐中甘油完全耗尽，此时our值下降为18-24molo2/l/h，得到初始发酵液。批发酵时间为18-23h；
(2)甘油补料：向步骤(1)所得初始发酵液中流加50％甘油和1.2％的ptm1的混合液体，初始流加速率控制在18-19ml/l/h，使our值以平滑的抛物线上升至115-125molo2/l/h，至od600＝300-400时，停止补料，此时our值为45-62molo2/l/h，得到二次发酵液；
(3)甲醇诱导：待步骤(2)中的二次发酵液温度降至室温，调节二次发酵液的ph值至4.5-5.5；饥饿培养菌种30-90min后，流加100％甲醇和1.2％的ptm1的混合液体，控制our值缓慢上升至180-220molo2/l/h时，结束发酵，得到发酵液；
4)将步骤(3)中所得发酵液离心，速率为12000rpm/min，时间2min，取上清液得到粗酶液；
5)将步骤4)中所得粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到葡萄糖氧化酶液体；
6)将步骤5)中所得葡萄糖氧化酶液体于-40—50℃环境中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶成品。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种基于our为控制参数的葡萄糖氧化酶制备方法，其中，对菌种的富集培养，可使菌种大量繁殖，增加葡萄糖氧化酶的产量；本发明中的毕赤酵母以甲醇和甘油为碳源，如果our值需要上升，说明毕赤酵母的营养物质减少，则需要增加甘油和甲醇的流加速度，此时溶解氧就会下降；如果our值需要下降，说明毕赤酵母的营养物质过量，则需要降低甘油和甲醇的流加速度，此时溶解氧上升。本发明以our值为反馈参数，且在发酵前期，只是通入少量的氧气，使其耗氧速率逐渐上升再逐渐下降，整个发酵过程使得our值为一个平滑的抛物线，而非呈直线下降趋势，这样可以使菌种在发酵的过程中逐渐达到发酵活性的最大值，最大限度地保证了菌种的质量；同时，以our为控制参数，可以准确反映发酵液中甲醇的多少，防止因甲醇浓度过高对细胞产生毒害作用，浓度过低导致细胞持续饥饿，生物量和表达量均下降，避免不必要的经济损失。
其次，由于毕赤酵母在发酵过程中，会产生一些代谢废物，在发酵结束后，发酵液中还会留有一些酵母活性细胞，因此，需要离心去除细胞和杂质，得到粗酶液，粗酶液中含有各种离子，将粗酶液通过离交柱去除离子，得到纯净葡萄糖氧化酶。
可选的，耗氧速率计算采用舜宇恒平尾气质谱仪对进气和尾气进行实时在线采集分析。
可选的，步骤1)中的一级培养基和二级培养基的组分均为：酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l。以四种原料配制ypda液体培养基，为其提供碳源和氮源，供毕赤酵母的大量繁殖。
可选的，步骤2)中发酵罐中营养液的组分为甘油40g、硫酸铵10g、硫酸钙0.93g、硫酸钾18.2g、氢氧化钾4.13g、磷酸26.7ml、硫酸镁14.9g、ptm14.35ml、水1l。
可选的，步骤2)中发酵罐中营养液的配制方法为：
1)称取、灭菌：将甘油40g、硫酸铵10g、硫酸钙0.93g、硫酸钾18.2g、氢氧化钾4.13g、磷酸26.7ml和1l水混合并加入发酵罐中，115-121℃，灭菌20-30min；甘油、硫酸铵、硫酸钙、硫酸钾、氢氧化钾和磷酸为毕赤酵母的生长提供大量元素和矿物质，保证其细胞生命活动的正常进行；对发酵罐进行灭菌，防止了其它杂菌的混入，对葡萄糖氧化酶的质量造成影响。
2)冷却：将灭菌后的发酵罐置于常温下下冷却至室温；
3)混合：将14.9g的硫酸镁和4.3ml的ptm1单独灭菌，并于接种前一同放入发酵罐中。微生物细胞的生命活动除了需求大量元素外，还需求微量元素，在接种前接入硫酸镁和ptm1微量元素，微量元素通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成了酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能；
具体实施方式
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
步骤一：300ml/1000ml摇瓶种子的制备
配制ypda液体培养基(酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、121℃灭菌30min)，按1％接种量接种重组毕赤酵母，于恒温培养箱中30℃，220rpm/min震荡培养24h，得到一级种子发酵液。
步骤二：菌种的扩大培养
用吸光光度计测定一级种子发酵液的od600为4.38时，按10％的接种量转移至二级种子发酵罐5lypda液体培养基中。二级种子发酵罐控制培养温度为30℃，时间为11h，do大于20％，以25％的氨水调节ph值至6.0，通风比为1vvm，发酵罐罐压为0.04mpa。
步骤三：50l发酵罐配料灭菌
1)分别称取1200g40g/l甘油、300g10g/l硫酸铵、27.9g0.93g/l硫酸钙、546g18.2g/l硫酸钾、123.9g4.13g/l氢氧化钾和801ml26.7ml/l磷酸，以适量水溶解后转入发酵罐中，定容至28l，115℃、灭菌20min；
2)称取447g14.9g/l硫酸镁和130.5ml4.35ml/lptm1，分别单独于115℃条件下灭菌20min，并于接种前将灭菌后的硫酸镁和ptm1加入发酵罐。
步骤四：建立our反馈调节机制
1)批发酵：将待发酵菌液发酵19h，控制初始our为0.5mol/l/ho2，逐渐上升至37.4mol/l/ho2，在此阶段，our值缓慢上升，发酵19h后，发酵液中甘油被完全消耗，do值会升至96.7％，此时our值开始下降至18mol/l/ho2，得到初始发酵液。
2)甘油补料：
向初始发酵液中流加50％甘油和12ml/l的ptm1的混合液体，初始补料速度为18ml/l/h，our以尽量平滑的抛物线形式上升至117mol/l/ho2，至od600为314时，our值下降至57.5mol/l/ho2，补料时间总计23h。
3)甲醇诱导
将二次发酵液降至室温，调节ph值至5.0，饥饿培养60min后流加100％甲醇和12ml/l的ptm1混合液体，使得our值缓慢上升至188.5mol/l/ho2，待our值开始下降时结束发酵，得到发酵液。
具体调控步骤为如果our值需要上升—提高补甘油或甲醇的速率—溶解氧下降—提高转速，如果our值需要下降—降低补甘油或甲醇的速率—溶解氧上升—降低转速。
步骤五：将发酵液12000rpm/min，离心2min，取上清液得到粗酶液。
步骤六：将粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液。
步骤七：将纯净酶液于-40—50℃环境中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶成品。
实施例二：
步骤一：300ml/1000ml摇瓶种子的制备
配制ypda液体培养基(酵母粉10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、121℃灭菌30min)，按1％接种量接种重组毕赤酵母，于恒温培养箱中30℃，220rpm/min震荡培养22h，得到一级种子发酵液。
步骤二：菌种的扩大培养
用吸光光度计测定一级种子发酵液的od600为5.6时，按10％的接种量转移至二级种子发酵罐5lypda液体培养基中。二级种子发酵罐控制培养温度为30℃，时间为10h，do大于20％，以25％的氨水调节ph值至6.0，通风比为1vvm，发酵罐罐压为0.04mpa。
步骤三：50l发酵罐配料灭菌
1)分别称取1200g40g/l甘油、300g10g/l硫酸铵、27.9g0.93g/l硫酸钙、546g18.2g/l硫酸钾、123.9g4.13g/l氢氧化钾和801ml26.7ml/l磷酸，以适量水溶解后转入发酵罐中，定容至28l，115℃、灭菌20min；
2)称取447g14.9g/l硫酸镁和130.5ml4.35ml/lptm1，分别单独于115℃条件下灭菌20min，并于接种前将灭菌后的硫酸镁和ptm1加入发酵罐。
步骤四：建立our反馈调节机制
1)批发酵：将待发酵菌液发酵17.5h，控制初始our为0.7mol/l/ho2，逐渐上升至43mol/l/ho2，在此阶段，our值缓慢上升，发酵17.5h后，发酵液中甘油被完全消耗，do值会升至98.6％，此时our值开始下降至23.5mol/l/ho2，得到初始发酵液。
2)甘油补料：
向初始发酵液中流加50％甘油和12ml/l的ptm1的混合液体，初始补料速度为18ml/l/h，our以尽量平滑的抛物线形式上升至121.5mol/l/ho2，至od600为350时，our值下降至61mol/l/ho2，补料时间总计20h。
3)甲醇诱导
将二次发酵液降至室温，调节ph值至5.0，饥饿培养90min后流加100％甲醇和12ml/l的ptm1混合液体，使得our值缓慢上升至198mol/l/ho2，待our值开始下降时结束发酵，得到发酵液。
具体调控步骤为如果our值需要上升—提高补甘油或甲醇的速率—溶解氧下降—提高转速，如果our值需要下降—降低补甘油或甲醇的速率—溶解氧上升—降低转速。
步骤五：将发酵液12000rpm/min，离心2min，取上清液得到粗酶液。
步骤六：将粗酶液缓慢通过离交柱，去除阴阳离子，得到纯净酶液。
步骤七：将纯净酶液于-40—50℃环境中冷冻干燥，得到葡萄糖氧化酶成品。
具体调控步骤为如果our值需要上升—提高补甘油或甲醇的速率—溶解氧下降—提高转速，如果our值需要下降—降低补甘油或甲醇的速率—溶解氧上升—降低转速。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。