本发明属于医学检验技术领域，尤其涉及一种非酒精性脂肪肝的mirna标志物及其应用。
背景技术：
mirna是天然存在于体内的21-22nt的非编码rna分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的rna。据估计，生物体内约有1/3的基因受mirna的调控。mirna与risc的复合体通过碱基配对可与靶基因mrna5’-utr或者3’-utr中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mrna降解，从而负调控靶基因的表达。
非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholrelatedfattyliverdisease,nafld)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人nafld患病率10％～30％，其中10％～20％为非酒精性脂肪性肝炎，后者10年内肝硬化发生率高达25％。
非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战，近期内非酒精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。
mirna是调节基因表达的内源性非编码小分子rna，在转录后水平对基因表达进行调控，参与细胞周期、凋亡、发育、分化和新陈代谢等生理过程。mirna在细胞中表达失调会导致非酒精性脂肪肝在内的多种疾病的发生，最新研究表明，一些mirna在非酒精性脂肪肝患者的血液中异常表达，但何种mirna与非酒精性脂肪肝的发生、发展有关仍未达成共识。因此有必要寻找与非酒精性脂肪肝发生、发展有关的mirna，从而为临床上判断和治疗非酒精性脂肪肝提供一种有效手段。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述问题，本发明的主要目的在于提供一种非酒精性脂肪肝的mirna标志物及其应用，可用于判断非酒精性脂肪肝。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种非酒精性脂肪肝的mirna标志物，所述mirna标志物选自：mirna-1911初始mirna、mirna-1911前体mirna以及成熟mirna-1911；所述mirna-1911初始mirna在人细胞内被剪切并表达为成熟mirna-1911；所述mirna-1911前体mirna在人细胞内被剪切并表达为成熟mirna-1911。
作为进一步的优选，所述mirna标志物还包括：对mirna-1911进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列。
作为进一步的优选，所述成熟mirna-1911包括mirna-1911-5p、mirna-1911-3p。
本发明还提供了所述mirna标志物在制备工具中的应用，所述工具用于预判非酒精性脂肪肝风险及诊断非酒精性脂肪肝。
作为进一步的优选，所述工具选自芯片和试剂盒；所述芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于mirna-1911的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测受试者血样中所述mirna-1911的表达水平的试剂，所述试剂包括针对mirna-1911的引物或探针。
作为进一步的优选，所述应用方法包括：
将受试者血样作为实验组，检测受试者血样中的mirna-1911水平；
将非酒精性脂肪肝的正常血样作为对照组，获得非酒精性脂肪肝的正常血样中的mirna-1911水平；
若所述实验组中的mirna-1911水平低于对照组中的mirna-1911水平，则判定受试者存在非酒精性脂肪肝的风险或者已经发生了非酒精性脂肪肝。
本发明还提供了所述mirna标志物在高通量测序平台中的应用。
作为进一步的优选，所述应用方法包括：
将受试者血样作为实验组，通过高通量测序获得受试者血样中的mirna-1911水平；
将非酒精性脂肪肝的正常血样作为对照组，获得非酒精性脂肪肝的正常血样中的mirna-1911水平；
若所述实验组中的mirna-1911水平低于对照组中的mirna-1911水平，则判定受试者存在非酒精性脂肪肝的风险或者已经发生了非酒精性脂肪肝。
本发明还提供了所述mirna标志物在制备抑制非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
作为进一步的优选，所述药物包含所述mirna-1911激动剂。
作为进一步的优选，所述mirna-1911激动剂是所述mirna-1911的寡核苷酸或所述mirna-1911模拟物。
本发明的有益效果是：本发明首次发现mirna标志物mirna-1911可用于判断非酒精性脂肪肝的进程和严重程度。经检验证明，mirna-1911可有效区分非酒精性脂肪肝样本和正常样本。在此基础上，mirna-1911还可用于制备抑制非酒精性脂肪肝的药物，以及用于预判非酒精性脂肪肝风险及诊断非酒精性脂肪肝的工具。本发明为临床在分子水平上开发非酒精性脂肪肝病提供了新的方法，同时为非酒精性脂肪肝的治疗提供了新的药物靶点。
附图说明
图1为本发明实施例mirna-1911在非酒精性脂肪肝人群和正常人群的血清中的表达情况。
图2为本发明实施例mirna-1911在非酒精性脂肪肝大鼠模型的血清中的表达情况。
图3a-3b为肝细胞系hepg2细胞加入油酸后的染色图。
图4为本发明实施例mirna-1911在加入油酸培养的肝细胞系hepg2中的表达情况。
具体实施方式
本发明通过提供一种非酒精性脂肪肝的mirna标志物及其应用，找到了与非酒精性脂肪肝发生、发展有关的mirna，从而为临床上判断和治疗非酒精性脂肪肝提供一种有效手段。
为了解决上述问题，本发明实施例的主要思路是：
本发明实施例非酒精性脂肪肝的mirna标志物，所述mirna标志物选自：mirna-1911初始mirna、mirna-1911前体mirna以及成熟mirna-1911；所述mirna-1911初始mirna能在人细胞内被剪切并表达为成熟mirna-1911；所述mirna-1911前体mirna能在人细胞内被剪切并表达为成熟mirna-1911。
应当知道，本发明实施例的mirna-1911包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整mirna-1911核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域人员熟知，为了保证mirna的稳定性，可以在mirna的一端或者两端增加保护性碱基，如tt，也可对mirna碱基进行修饰，但是不影响mirna的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响mirna-1911功能的条件下，对mirna-1911进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的一些具体的实施方式中，所述mirna-1911是成熟mirna-1911。所述成熟mirna-1911包括mirna-1911-5p、mirna-1911-3p，它们享有共同的种子序列。
虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟mirna-1911，但是本领域技术人员可以预期，初始mirna(pi-mirna-1911)、前体mirna(pre-mirna-1911)将可以获得与成熟mirna-1911同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始mirna(pi-mirna-1911)、前体mirna(pre-mirna-1911)加工为成熟mirna-1911。
本发明的mirna-1911核酸分子可以单链或双链的形式存在。成熟的mirna-1911主要呈单链形式，而mirna-1911前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是rna、dna、pna、lna的形式。
本发明还提供了所述mirna标志物在制备工具中的应用，所述工具用于预判非酒精性脂肪肝风险及诊断非酒精性脂肪肝。
本发明实施例的实验证明已发生非酒精性脂肪肝的尿液中mirna-1911的水平显著低于为未发生非酒精性脂肪肝的血液、血清或血浆中mirna-1911的水平。因此，与未发生非酒精性脂肪肝的血液、血清或血浆中mirna-1911的水平相比，如果受试者尿液中mirna-1911的水平显著降低，那么则可以判断该受试者已发生非酒精性脂肪肝，从而采取预防非酒精性脂肪肝的方案或者为临床治疗方案的制定提供诊断基础。
另外，与不发生非酒精性脂肪肝的血液、血清或血浆中mirna-1911的水平相比，如果受试者血液、血清或血浆中mirna-1911的水平显著境地，则表明受试者发生非酒精性脂肪肝。
进一步，上述预判非酒精性脂肪肝风险、判断非酒精性脂肪肝是否发生的工具包括但不限于，芯片、试剂盒。所述工具包括用于待测样本中mirna-1911表达水平的试剂。所述试剂可以是针对mirna-1911的引物或探针。
所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于mirna-1911的部分或全部序列。所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于判断非酒精性脂肪肝是否发生的mirna的寡核苷酸探针。将多种mirna的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种mirna指标联合判断非酒精性脂肪肝的情况也包含在本发明的保护范围之内。
进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的mirna芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dt串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的mirna芯片。
所述试剂盒包括用于检测受试者血液、血清或血浆中mirna-1911的表达水平的试剂。与未发生非酒精性脂肪肝的血液、血清或血浆中的mirna-1911的表达水平比较，若通过试剂盒检测血液、血清或血浆中mirna-1911的表达水平显著降低，则判断该受试者的非酒精性脂肪肝风险很高或者已发生非酒精性脂肪肝。
进一步，所述试剂包括针对mirna-1911的引物和/或探针。所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的可用于判断非酒精性脂肪肝风险，或者判断非酒精性脂肪肝是否发生的mirna的引物和/或探针。将多种mirna的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种mirna指标联合判断非酒精性脂肪肝的情况也包含在本发明的保护范围之内。
本发明实施例还提供了上述mirna-1911在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待检测血液、血清或血浆样本中mirna-1911的表达水平，将待测样本的结果同未发生非酒精性脂肪肝的血液、血清或血浆样本相比，容易判断待测样本是否存在非酒精性脂肪肝的风险或者容易判断待测样本是否已经发生了非酒精性脂肪肝。因此，经过高通量测序获得mirna-1911与非酒精性脂肪肝相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明的mirna-1911可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达mirna-1911的dna片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及eb病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pcmv-myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna3.1表达载体、pegfp表达载体、pefbos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pbin438、pcambia1301等。
可以表达mirna-1911的dna片段可以通过如下方式获取：从mirna数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找mirna-1911在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定mirna-1911初始mirna的位置，在mirna-1911初始mirna位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达mirna-1911的dna片段。
本发明还提供了前面所述的mirna-1911在制备抑制或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
本发明的实验证明mirna-1911与非酒精性脂肪肝相关，在此基础上，通过促进mirna-1911的表达可用于抑制非酒精性脂肪肝的发生或发展的风险。
进一步，所述药物包含mirna-1911激动剂。所述mirna-1911激动剂能够促进mirna-1911的表达或者能够激活mirna-1911的功能。所述mirna-1911激动剂的抑制靶标不限于mirna-1911本身，还包括mirna-1911的上下游，例如：编码mirna-1911的基因组序列，mirna-1911靶基因、调控mirna-1911的蛋白或者基因。
进一步，mirna-1911抑制剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。
优选地，所述mirna-1911抑制剂是mirna-1911的反义寡核苷酸或者mirna-1911模拟物。
根据mirna-1911序列容易设计出它的反义寡核苷酸，将反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调mirna-1911的表达。“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，as-ons或aso)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的dna分子或rna分子或其类似物。
在本发明实施例中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(lockednucleicacid，lna)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将dna骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
本发明的抑制非酒精性脂肪肝的药物还包含药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述药物可以单独施用；或者与其他能够抑制非酒精性脂肪肝的药物进行组合施用。
所述药物可以离体施用：将mirna-1911或者mirna-1911的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后，输回人体。
所述药物可以体内施用：将mirna-1911或者mirna-1911的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸dna或rna。
所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体地，受试者是器官、组织、细胞。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例证明mir-1911在非酒精性脂肪肝人群的血清样本中低表达。
1.mirna提取
使用tiangen的mirna提取试剂盒，每200μl血清中加入等体积裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min,12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无rna酶的水，室温12,000rpm离心2min。
2.逆转录
将10pg-1μg的rna模板与2μl10倍缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μl引物、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μl特异性rt引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl5倍缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。
3.q-pcr检测
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/l)1μl，反向引物(5μm/l)1μl，模板cdna2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min,(95℃20s，60℃55s)40个循环。以sybrgreen作为荧光标志物，在荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。
4.结果
如图1所示，在非酒精性脂肪肝人群血清中的mirna-1911含量显著低于正常人群(*p<0.05)，mirna-1911能够作为检测非酒精性脂肪肝的标志物。
实施例2
本实施例证明mirna-1911在非酒精性脂肪肝大鼠模型的血清中低表达。
1.非酒精性脂肪肝动物模型
幼年大鼠(3周龄)，每日喂养含2％胆固醇、10％猪油、0.3％胆酸钠等成分的高脂饲料，连续8周。立即抽取全血，测定血中总胆固醇(tc)、三酰甘油(tg)、游离脂肪酸(ffa)、丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、三酰甘油(tg)、游离脂肪酸(ffa)的含量，模型大鼠血清中tc、tg、ffa、ast、alt升高。
2.mirna提取和反转录，参考实施例1中的实验过程。
3.q-pcr检测，参考实施例1中的实验过程
4.结果
如图2所示，在非酒精性脂肪肝大鼠模型的血清中，mirna-1911的含量显著低于喂养普通饲料的大鼠(*p<0.05)，mirna-1911是非酒精性脂肪肝发生过程的标志物。
实施例3
本实施例证明mirna-1911在加入油酸培养的hepg2细胞中表达量降低。
1.加入油酸培养hepg2细胞，建立油脂含量较高的细胞模型。将hepg2细胞以2×105/孔接种于六孔培养板中，取生长期细胞进行实验。加入无血清的dmem培养基，培养24h后，加入含1mm油酸和10％bsa的dmem培养再24h，建立油脂含量较高的细胞模型。对照模型采用无血清的dmem培养基培养，不含油酸和bsa。利用油红染色，显示模型组细胞中油脂含量高于对照组，如图3a-3b所示。
2.mirna提取和反转录，参考实施例1中的实验过程。
3.q-pcr检测，参考实施例1中的实验过程
4.结果
如图4所示，在加入油酸的hepg2细胞模型中，mirna-1911的含量显著低于对照组细胞(*p<0.05)。
上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：
本发明实施例首次发现mirna标志物mirna-1911可用于判断非酒精性脂肪肝的进程和严重程度。经检验证明，mirna-1911可有效区分非酒精性脂肪肝样本和正常样本。在此基础上，mirna-1911还可用于制备抑制非酒精性脂肪肝的药物以及预断、诊断工具。本发明为临床在分子水平上开发非酒精性脂肪肝病提供了新的方法，同时为非酒精性脂肪肝的治疗提供了新的药物靶点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京大学首钢医院
<120>一种非酒精性脂肪肝的mirna标志物及其应用
<130>2017
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>23
<212>rna
<213>人工序列()
<400>1
ugaguaccgccaugucuguuggg23