一种提高水稻抗旱能力的烟曲霉的抗氧化产物的分离鉴定及其应用的制作方法

本发明涉及一种内生烟曲霉次级代谢产物的分离纯化方法及其应用，经过紫外(uv)、质谱(ms)、核磁共振(nmr)测试确定结构，实验证明其可以降低干旱水稻的pro、mda含量，并通过调节sod、pod、hsp70和nadph氧化酶的途径来协助水稻抵抗干旱胁迫。

背景技术：

水稻(oryzasativa)原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。世界上近一半人口，都以大米为食，故水稻的种植与生产对国计民生有重要影响。

烟曲霉属于半知菌类真菌，本菌主要存在于谷物、污染的食品、土壤和霉腐物中，或寄藏于种子上，能引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉铃和苹果等，引起果实腐烂。本菌能产生烟曲棒麦角素(fumigaclavines)、烟曲霉震颤素(fumitremorgins)，烟曲霉素(fumigillin)、烟曲霉毒素(fumitoxins)、疣孢青霉原(verruculogen)等多种次生代谢产物，但关于烟曲霉对植物的促生作用，目前国内外还鲜有报道。

nfa可用作一种新抗生素，能选择性地抗结核分枝杆菌，也具有对由花生四烯酸及胶原刺激的兔血小板聚集的抑制活性，ic50值依次是2.25、6.00tag/ml，通过单次腹膜内剂量的该物质可以降低小鼠由花生四烯酸诱导的死亡率，并其可由酪氨酸和通过四氢叶酸代谢途径生成的甘氨酸生物合成，且其对大肠杆菌显示了拮抗作用，同时显示出针对du145、a-549和hela细胞系的中等细胞毒性。

本发明从一株烟曲霉sg-17产物中分离纯化得到具有抗氧化活性的物质nfa，它能通过调节pro、mda、sod、pod、hsp70和nadph氧化酶的含量来协助水稻抵抗干旱胁迫。可服务于开发新型抗氧化剂和水稻的种植与生产。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供具抗氧化活性物质nfa的分离纯化过程和制备条件，及其分子结构，服务于开发新型抗氧化剂。

一种烟曲霉的抗氧化产物，该抗氧化产物为(z)-n-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。本发明nfa在分离鉴定过程中，室温下1天后会出现渐变的现象，产生其异构体(e)-n-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺(enfa)。薄层层析(tlc)分离nfa时，enfa出现在nfa的下方。所述的烟曲霉的抗氧化产物，所述的烟曲霉保藏名称为aspergillusfumigatussg17；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015年5月17日；保藏编号为，m2015286。

本发明该提供一种用于提高水稻抗干旱胁迫的改良剂，该改良剂为(z)-n-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺。

所述的水稻生物改良剂，该改良剂含有抗氧化产物为(z)-n-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺，该抗氧化剂的使用浓度为：0.05-0.2mg/ml，进一步优选为0.1mg/ml。

所述的抗氧化产物(z)-n-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺的分离方法，包括如下步骤：

(1)菌株活化及发酵培养：将内生真菌烟曲霉sg-17接种在pda固体培养基上，等生长到表型单一菌落时，挑取孢子放在sda液体发酵培养基培养14d，得到内生真菌发酵菌悬液；

(2)发酵液酯相初提物的制取：将内生真菌发酵菌悬液真空抽滤分离，得到菌体与滤液；乙酸乙酯萃取滤液得到发酵液乙酸乙酯相，发酵液乙酸乙酯相旋蒸至粘稠状，收集待用，为发酵液酯相初提物；

(3)tlc分离发酵液酯相初提物：以石油醚与丙酮以体积比1：1-2条件下分离发酵液酯相初提物后，得到分离样品；分离样品分离的片段为多段时，采用t-aoc法和dpph自由基清除法测定多个片段的抗氧化活性，抗氧化活性高则进行高效液相色谱分析。

(4)高效液相色谱分析：取分离样品用甲醇完全溶解，用微孔过滤器过滤，取滤液进行半制备hplc分离、纯化，得到化合物nfa。

色谱分离纯化条件：分析柱为cosmosilms-iirp-c18色谱柱5μm，250×10mm分析型，流动相：乙腈：水＝60：40(v/v)，流速：3.0ml/min，紫外检测波长：254nm；半制备hplc分离nfa时，enfa保留时间约为9.58-10.00min，nfa保留时间约为10.78-11.30min。

胁迫试验表明，nfa可使干旱水稻的pro、mda含量显著降低，能有效地协助水稻抵抗干旱胁迫。

本发明nfa具有调节水稻sod、pod、hsp70和nadph氧化酶能力，可使干旱状态下水稻的sod、pod、hsp70和nadph氧化酶含量升高，在提高水稻干旱能力方面有显著作用，为明确植物的抗氧化胁迫代谢途径及提高高等植物对氧化胁迫的抵抗性奠定基础。

附图说明

图1本发明的nfa和enfa结构式。其中nfa(左)和enfa(右)的结构式。

图2本发明的nfa和enfa分离的tlc图。

图3本发明的nfa和enfa的hplc图。

图4本发明的nfa作用于干旱胁迫水稻的效果图。

图5本发明的nfa对水稻干旱生理的影响。

图6本发明的nfa对干旱逆境下水稻的氧化代谢的影响。

具体实施方式

实施例一：抗氧化活性物质nfa的分离纯化过程和制备条件，及其分子结构。

菌株活化及发酵培养：将储存在冰箱内的内生真菌烟曲霉sg-17接种在pda固体培养基上，在28℃环境中培养5d，等生长到表型单一菌落时，利用无菌接种针挑取孢子放在150mlsda液体发酵培养基内(500ml锥形瓶)，于28℃、120rmp培养14d。

发酵液酯相粗提物的制取：将内生真菌发酵菌悬液通过真空抽滤装置过滤分离，得到菌体与滤液。用等量乙酸乙酯萃取滤液3次，将萃取液合并，得到发酵液乙酸乙酯相。发酵液乙酸乙酯相在42℃，0.1mpa下旋蒸至粘稠状，收集待用，为内生真菌发酵液酯相初提物。

tlc分离sg-17发酵液酯相初提物：分离条件：石油醚：丙酮＝1：1(体积比)，分离sg-17发酵液酯相初提物后，得到4个分离片段(fr.1-fr.4)。利用t-aoc法和dpph自由基清除法测定fr.1-fr.4的抗氧化活性，经测定，fr.2的抗氧化能力最高，因此取该片段进行半制备hplc制备。(结果如下)

高效液相色谱(hplc)分析fr.2：取少量fr.2样品并用少量甲醇完全溶解，用0.22μm有机系微孔过滤器过滤，取滤液进行半制备hplc分离、纯化，得到化合物nfa。色谱分离纯化条件：分析柱为cosmosilms-iirp-c18色谱柱(5μm，250×10mm分析型)，流动相：乙腈：水＝60：40(v/v)，流速：3.0ml/min，紫外检测波长：254nm。半制备hplc分离nfa时，enfa保留时间约为9.58-10.00min，nfa保留时间约为10.78-11.30min。

nfa向enfa的转化：室温下1天后nfa会出现渐变的现象，产生其异构体enfa。tlc分离nfa时，enfa出现在nfa的下方。

nmr检测：将经hplc分离、纯化后得到的单体化合物nfa用冷冻干燥仪冷冻干燥，用0.5ml氘代dmso溶解nfa，将溶液装入核磁管，利用brukeravance400mhz核磁共振波谱仪测定nfa的氢谱和碳谱，具体如下：

实施例二：nfa协助水稻抵抗干旱胁迫浓度的确定

水稻幼苗制备：将从4℃冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4d，促使其生根发芽，并每隔12h更换一次水。4d后将其种植在盛装有土壤的塑料杯中，定期浇水，7d后即可获得水稻日本晴幼苗。

nfa用量的确定：根据相关文献报道，将0.1mgnfa置于ep管中，加入少许dmso溶解，以蒸馏水定容至1ml，使样品充分溶解，配制终浓度是0.1mg/mlnfa溶液备用。选取长势良好、大小一致的水稻幼苗，向dr+nfa组加入nfa溶液，向dr+pro组加入5×10^-5mol/l脯氨酸溶液，向dr+vc组加入0.1mg/mlvc溶液，向正常组加入自来水溶液，dr组不添加任何溶液，每组重复3次。将上述幼苗放置室温下培养，使各幼苗土壤中的水分自然下降，观察各组水稻苗生长状态，20天后拍照记录。

实验结果见图：(a)正常组水稻苗，(b)dr组水稻苗，(c)dr+nfa组水稻苗，(d)dr+pro组水稻苗，(e)dr+vc组水稻苗。结果表明浓度为0.1mg/ml的nfa可协助水稻抵抗干旱胁迫，与pro和vc作用效果相当，水稻表型差异显著，且用量少，经济节约，故选用此浓度进行后期实验(图4)。

实施例三：nfa对水稻干旱生理的影响

干旱胁迫试验：将0.1mgnfa置于ep管中，加入少许dmso溶解，以蒸馏水定容至1ml，使样品充分溶解，配制终浓度是0.1mg/mlnfa溶液备用。选取长势良好、大小一致的水稻幼苗，向-dr+nfa、dr+nfa组加入nfa溶液，向dr+pro组加入5×10^-5mol/l脯氨酸溶液，向dr+vc组加入0.1mg/mlvc溶液，向-dr组加入自来水溶液，dr组不添加任何溶液，每组重复3次。干旱胁迫前一天向-dr+nfa、dr+nfa、dr+pro、dr+vc、-dr组幼苗加入50ml相应溶液并向dr组幼苗加入50ml自来水，胁迫期间只向-dr+nfa、-dr组幼苗补充50ml自来水。将上述幼苗放置室温下培养，使各幼苗土壤中的水分自然下降，干旱胁迫20d后测定水稻pro、mda含量，确定nfa对水稻干旱生理的影响。

实验结果表明：dr+nfa比dr的pro含量显著降低。由于在植物遭受逆境伤害时，其pro含量会上升，表明nfa能有效地协助水稻抵抗干旱胁迫。dr+nfa比dr+pro的pro含量显著降低，表明nfa协助水稻抵抗干旱胁迫的效果优于pro。dr+nfa比dr+vc的pro含量显著降低，表明nfa协助水稻抵抗干旱胁迫与抗氧化有关。

dr+nfa比dr的mda含量显著降低。由于在植物遭受逆境伤害时，其mda含量会上升，表明nfa能有效地协助水稻抵抗干旱胁迫。dr+nfa比dr+pro的mda含量略高，dr+nfa比dr+vc的mda含量略高，表明nfa协助水稻抵抗干旱胁迫与抗氧化有关(图5)。

实施例四：nfa调节水稻的氧化稳态以抵抗干旱胁迫

干旱胁迫试验：提取nfa后，配制成0.1mg/ml的溶液，将其添加到水稻幼苗中，分别在干旱胁迫第5、10、20d测定水稻的sod、pod、hsp70和nadph氧化酶含量，揭示干旱逆境下nfa与氧化稳态的关系。

sod含量：sod在植物体内是一种能使超氧化物发生歧化反应生成o2和h2o2的抗氧化剂。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,复原因自由基造成的对细胞伤害。所以sod的测定可以反映一定时间植物代谢和抗逆性的变化。利用江苏宝莱生物科技有限公司的植物超氧化物歧化酶(sod)酶联免疫分析

试剂盒测定，该试剂盒利用双抗体夹心法测量植物sod水平。

pod含量：pod普遍产生于植物内，并且其酶活较高。氧化还原反应中的h2o2被该酶催化，在氧化其它物质过程时，h2o2通过被还原为h2o来去除机体内的h2o2，因此，pod是植物细胞内其中的一个保护酶。除此之外，植物生长素的氧化、呼吸、光合作用、木质素的形成等过程均与pod有关。所以pod的测定可以反映一定时间植物代谢和抗逆性的变化。利用江苏宝莱生物科技有限公司的植物过氧化物酶测定试剂盒测定，该试剂盒利用双抗体夹心法测量植物pod的含量。

hsp70含量：hsp70是植物在高温、冷、盐、干旱、病害、机械创伤等，或一些化学物质如乙醇、茉莉酸甲酯、重金属、砷等胁迫下产生的一类重要的胁迫蛋白，它具有防止蛋白质聚合，协助没有功能的蛋白质再次折叠的作用，在植物生长发育和逆境胁迫方面均发挥重要的功能。利用江苏宝莱生物科技有限公司的植物热激蛋白70测定试剂盒测定，该试剂盒利用双抗体夹心法测定植hsp70的含量。

nadph氧化酶含量：nadph氧化酶为植物机体中ros生成的关键酶。当外部因素诱导后，nadph氧化酶可以利用其本身的活化、失活快速增加、减少ros，因此在植物生长发育时应对生物、非生物胁迫起积极功能。利用江苏宝莱生物科技有限公司的植物nadph氧化酶测定试剂盒测定，该试剂盒利用双抗体夹心法测定植物nadph氧化酶的含量。

实验结果分析：干旱15d后，nfa处理组sod活性明显高于其他组(p<0.01)(图6a)。pod酶活性的变化在10天内具有相似的趋势(图6b)。sod和pod都是水稻在干旱胁迫重要的ros清除剂，因此，nfa通过抗氧化酶调节氧化稳态，可以帮助水稻抵御干旱胁迫。一旦植物遭受干旱，就会诱导nadph氧化酶产生一定量的ros。在干旱5天以后用nfa处理后水稻的nadph氧化酶含量要高得多(图6c)。结果表明，在干旱初期，nfa可以上调nadph氧化酶产生ros，进而参与抗逆应激代谢。同样在干旱初期，nfa也能诱导广泛参与ros代谢的hsp70的表达(图6d)，进一步说明nfa可通过调控氧化稳态来提高水稻的抗旱性。