本发明属于生物发酵工程领域，涉及一种以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的复配菌种发酵处理南极磷虾获得富含益生菌的抗氧化肽的方法，具体涉及一种南极磷虾抗氧化肽及其制备方法与应用。
背景技术：
南极磷虾(euphausiasuperba)是地球上生物量最大、繁衍最成功的的生物之一，是一种重要的海洋新资源。我国对南极磷虾的开发尚处于初级阶段，主要体现在对磷虾油或虾青素的提取上，对于磷虾蛋白的回收利用相对较少。目前，南极磷虾粗蛋白多用作低值鱼饲料，且提取时多采用强酸强碱法，得率低，蛋白质结构被破坏，营养价值低；而由磷虾蛋白制得的磷虾肽具有多种生物活性，例如抗氧化、抑菌、抗疲劳等，在功能食品和化妆品领域拥有巨大的应用潜力。但是磷虾肽在制备过程中往往伴随着很浓重的虾腥味，限制了其后续的开发和应用。因此，寻找合适的工艺方法对磷虾蛋白进行加工和去腥是提高磷虾资源综合利用的关键。
枯草芽孢杆菌是美国食品药物管理局公布的安全菌种，是当今工业生产中应用最广泛的菌种之一。通过合适的发酵条件，枯草芽孢杆菌可以产生活力较高的中性蛋白酶，能够应用于食品工业当中。凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)是近年来益生菌领域的后起之秀，除了具有乳酸菌和双歧杆菌等的保健功效外，还具有丰富的酶系统以及耐高温、耐酸和耐胆盐等高抗逆性能，且具有较强的抑制肠道致病菌能力。在国外已经广泛应用于医药、食品、保健、畜牧和水产等行业。
本发明利用枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌复配后的菌种对南极磷虾粉进行发酵，去除南极磷虾粉的虾腥味，并利用发酵过程中产生的蛋白酶将磷虾蛋白降解为具有抗氧化活性的磷虾肽。此举不仅可以大大提高磷虾蛋白的附加值，为保健品行业提供大量优质的原料，还可以为磷虾蛋白的深加工开辟一条新的途径。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的复配菌种发酵去除南极磷虾粉的腥味，并制备富含益生菌的磷虾抗氧化肽的方法，从而提高南极磷虾蛋白质的综合利用率，提高磷虾蛋白产品的附加值。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的南极磷虾抗氧化肽。
本发明的再一目的在于提供上述南极磷虾抗氧化肽的应用。所述南极磷虾抗氧化肽应用于保健品和/或功能性食品领域。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种南极磷虾抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将脱脂南极磷虾粉、水和碳源混匀，调节溶液ph为6.5～7.5，灭菌，得到南极磷虾粉溶液；
(2)将枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌分别接种于液体培养基，30～45℃条件下摇床培养20～24h，调节孢子的浓度，得到枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液；
(3)将枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液按照体积比1:1.5～1:4进行复配，得到复配菌液；再将复配菌液与南极磷虾粉溶液进行混合，在35～45℃条件下摇床发酵35～45小时，离心，将上清液浓缩，干燥，得到南极磷虾抗氧化肽。发酵时间优选为35～42小时。
步骤(1)中所述脱脂南极磷虾粉与水的质量比为1:5～1:10；所述碳源的用量为脱脂南极磷虾粉与水的总质量的5％～10％；脱脂磷虾粉为磷虾粉经提取磷虾油后剩余的下脚料。
步骤(1)中所述碳源为麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉中一种以上；
步骤(1)中所述灭菌是指110～130℃条件下湿热灭菌25～45min，灭菌后降温到35-45℃；
步骤(2)中所述液体培养基通过以下方法得到：称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000ml，调节ph至6.5～7.5，灭菌，即得液体培养基；所述灭菌是指110～130℃条件下湿热灭菌25～45min，灭菌后降温到35～45℃；
步骤(2)中所述枯草芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为106～109个/ml；凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为106～109个/ml；
步骤(2)中所述培养的温度优选为30～35℃；
步骤(2)中所述摇床培养的转速为100～200rpm；
步骤(3)中所述复配菌液中枯草芽孢杆菌与凝结芽孢杆菌的孢子个数比为1:1.5～1:4；
步骤(3)中所述复配菌液的用量为南极磷虾粉溶液体积的5％～10％；
步骤(3)中所述摇床培养的转速为100～150rpm；
步骤(3)中所述离心转速为2500～4000r/min所述浓缩为30～45℃旋转浓缩到30～45bx(可溶性固形物含量为30-45％)，所述干燥为喷雾干燥。
所述枯草芽孢杆菌保藏号cicc10075,保藏单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心；凝结芽孢杆菌保藏号cctccm2017054，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
利用复配菌种进行发酵，制备的南极磷虾肽中三甲胺的相对含量为2.49％～5.17％，无明显虾腥味，产品中多肽分子量为1000-7000da，含量为60-80％，产品的teac抗氧化能力为60-200μmtrolox/mg，orac抗氧化能力为50-140μmtrolox/mg，产品中活菌数量达到1×106-107cfus/g。
本发明通过复配枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌对脱脂南极磷虾粉进行发酵，去除虾腥味，同时利用发酵过程中菌株代谢产生的蛋白酶水解磷虾蛋白，制备具有抗氧化活性的磷虾肽，最终得到富含凝结芽孢杆菌和b族维生素的磷虾肽产品。
本发明所采用的南极磷虾粉丰富易得，上述方法可去除虾腥味并制备出富含益生菌凝结芽孢杆菌的抗氧化南极磷虾肽产品，解决了南极磷虾粉综合利用率低的问题，同时也大大提高了产品的附加值。利用复配菌种进行发酵，制备的南极磷虾肽中三甲胺的相对含量为2.49％～5.17％，无明显虾腥味，产品中多肽分子量为1000-7000da，含量为60-80％，产品的teac抗氧化能力为60-200μmtrolox/mg，orac抗氧化能力为50-140μmtrolox/mg，产品中活菌数量达到1×106-107cfus/g。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明的抗氧化肽具有较高的抗氧化活性，磷虾肽没有虾腥味，且与益生菌有协同效果；产品口感好、无异味，且富含凝结芽孢杆菌，活菌数量达到1×106-108cfus/g。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明采用的菌株为菌株为枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌保藏号cicc10075，中国工业微生物菌种保藏管理中心；凝结芽孢杆菌保藏号cctccm2017054，中国典型培养物保藏中心。
实施例1
一种南极磷虾抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取脱脂南极磷虾粉100g，加入去离子水500g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量5％的麦芽糖混匀，调节ph为6.5，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至35℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000ml，调节ph至7.0，得液体培养基；分别取100ml液体培养基，121℃灭菌30min，冷却至35℃，分别接种枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，在120rpm、35℃条件下摇床培养20小时，得到枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液；枯草芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为2.4×108个/ml和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为1.6×108个/ml；
(3)调整枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度都为108个/ml，然后按照体积比1:1.5将枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液进行复配，得到复配菌液；
(4)将复配菌液按5％的接种量(复配菌液的用量为南极磷虾粉溶液体积的5％)接种于南极磷虾粉溶液中，然后在120rpm、35℃条件下摇床发酵35小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至30bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽无虾腥味，三甲胺相对含量降低到4.96％，肽含量为68％，子量分布在2000-5000da之间，teac抗氧化能力为135.1μmtrolox/mg，orac抗氧化能力为72.4μmtrolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到1.5×106cfus/g。
实施例2
一种制备南极磷虾抗氧化肽的方法，其步骤包括：
(1)取南极磷虾粉100g，加入去离子水800g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量8％的麦芽糖混匀，调节ph为7.0，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至40℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000ml，调节ph至7.0，得培养基；分别取100ml培养基，121℃灭菌30min，冷却至40℃，分别接种枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，在130rpm、40℃条件下摇床培养24小时，得到枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液；枯草芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为1.9×108个/ml和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为1.3×108个/ml；
(3)调整枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度都为108个/ml，然后按照体积比1:3将枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液进行复配，得到复配菌液；
(4)将复配后的菌种按8％的接种量(复配菌液的用量为南极磷虾粉溶液体积的8％)接种于磷虾粉水溶液中，然后在150rpm、40℃条件下摇床发酵40小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至40bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽成品无虾腥味，三甲胺相对含量降低到4.13％，肽含量为71％，分子量分布在1000-5000da之间，teac抗氧化能力为196.5μmtrolox/mg，orac抗氧化能力为123.3μmtrolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到1.3×107cfus/g。
实施例3
一种制备南极磷虾抗氧化肽的方法，其步骤包括：
(1)取南极磷虾粉100g，加入去离子水1000g，添加脱脂南极磷虾粉和去离子水总质量10％的麦芽糖混匀，调节ph为7.0，在121℃条件下湿热灭菌30min，冷却至45℃，得到南极磷虾粉溶液；
(2)称取蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，氯化钠5.0g，加水定容至1000ml，调节ph至7.0，得培养基；分别取100ml培养基，121℃灭菌30min，冷却至45℃，分别接种枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，在150rpm、45℃条件下摇床培养24小时，得到枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液；枯草芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为3.6×108个/ml和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度为2.3×108个/ml；
(3)调整枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液中孢子的浓度都为108个/ml，然后按照体积比1:4将枯草芽孢杆菌种子液和凝结芽孢杆菌种子液进行复配，得到复配菌液；
(4)将复配后的菌种按10％的接种量(复配菌液的用量为南极磷虾粉溶液体积的10％)接种于磷虾粉水溶液中，然后在150rpm、45℃条件下摇床发酵45小时，在3000r/min条件下离心10min，将上清液于40℃旋转浓缩至45bx，喷雾干燥得到富含益生菌的南极磷虾抗氧化肽。
本实施例制备的南极磷虾抗氧化肽成品无虾腥味，三甲胺相对含量降低到3.25％，肽含量为61％，分子量分布在3000-7000da之间，teac抗氧化能力为73.7μmtrolox/mg，orac抗氧化能力为67.6μmtrolox/mg，产品中凝结芽孢杆菌的数量达到1.1×106cfus/g。