可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶及其制备方法和用途与流程

本发明属于水凝胶高分子材料领域，具体涉及一种可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶及其制备方法和用途。

背景技术：

聚乙二醇(PEG)水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的聚合物，PEG具有良好的生物相容性、无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，经过美国FDA认可，是非常有吸引力的潜在的组织工程支架和药物运输材料。目前所报道的PEG水凝胶大多是通过Michael加成聚合或自由基引发聚合得到。自由基引发聚合的主要缺点是自由基交联会大大减少封装体内细胞生存能力，并且原位交联的水凝胶在体内的传输也是不灵便的。相比之下，Michael加成聚合避免了使用细胞毒性的自由基和紫外线，而是需要一个亲核的缓冲试剂，如三乙醇胺(TEA)或N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)来促进反应。

PEG水凝胶的降解性可以通过引入可水解、酶解或者其他降解方式的分子来实现。而且可以通过(i)改变PEG分子量或者浓度，(ii)形成双网络结构，(iii)引入“无机”或者“有机-无机”增强剂的方法达到可控的机械强度。而有机-无机杂化材料是近年来热门研究的新型高性能材料，受到许多材料、化学研究者的青睐。

多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)是一种分子水平上的纳米杂化材料，分子尺寸在1～3nm之间，由核心的Si-O-Si键组成的无机骨架和外围的有机取代基组成有机-无机杂化结构，外围的有机取代基赋予了POSS良好的分子设计性。POSS在对聚合物韧性、热性能和力学性能上有很好的改善，同时，POSS无毒无味，具有良好的生物相容性，被认为是新一代生物医用材料。但是，由于POSS的疏水性，目前研究的POSS杂化水凝胶都是在有机溶剂(如甲苯，四氢呋喃(THF)，二甲基亚砜(DMSO)等)或者混合溶剂中(如丙酮与水的混合溶剂)进行成胶，而有机溶剂会降低水凝胶3D包埋的生物细胞的活性，这样大大局限了POSS杂化水凝胶在生物材料上的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶及其制备方法和用途。本发明通过调控巯基多面体低聚倍半硅氧烷(POSS-SH)在POSS-PEG杂化水凝胶中的质量分数获得性能(孔隙大小、机械强度、溶胀性、降解率)可控的水凝胶。本发明得到的水凝胶成胶速度快、力学强度好、生物相容性好、无毒且能够水解降解，是一种具有发展潜力的组织工程支架材料。

本发明所提供的技术方案如下：

一种可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1)4-arm-PEG-MAL与POSS-SH在溶剂中通过Michael加成反应得到POSS-PEG预聚物；

2)将POSS-PEG预聚物与交联剂PEG-SH溶于弱碱性缓冲液中得到预成胶溶液，将所述预成胶溶液在反应温度下通过Michael加成交联聚合得到可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶。

上述技术方案通过马来酰亚氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-MAL)、POSS-SH和PEG-二巯基丙酯(PEG-SH)可以合成得到POSS-PEG杂化水凝胶。

上述反应过程由如下反应式表示：

具体的，POSS-SH与4-arm-PEG-MAL的质量百分比大于零且小于等于4％。

优选的，POSS-PEG预聚物残留的功能基-MAL与PEG-SH交联剂功能基-SH的摩尔比例为1:0.9～1.1，更优选的，摩尔比例为1:1。

具体的，步骤2)中，所述的反应温度为0～40℃，优选的，为36～38℃，更优选的，为37℃。

上述技术方案中，反应温度可以匹配生化培养箱的培养温度。

具体的，步骤1)中，在非质子溶剂中进行Michael加成反应。

具体的，步骤2)中：缓冲液为TEA。

具体的，缓冲液的浓度为3～10mM；成胶时间为5～15min。

上述技术方案提供了Michael加成聚合所需要的亲核的缓冲试剂，避免了使用细胞毒性的自由基和紫外线，与细胞培养和细胞封装的溶液环境匹配。

更优选的，将4-arm-PEG-MAL与不同质量分数的POSS-SH在四氢呋喃中通过Michael加成反应得到POSS-PEG预聚物，旋蒸除去四氢呋喃。将POSS-PEG预聚物与PEG-SH交联剂溶于低浓度三乙醇胺(TEA)缓冲液(pH＝7.4)制成预成胶溶液，预成胶溶液转移至模具中放入37℃生化培养箱反应，通过Michael加成交联聚合得到可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶。POSS-PEG预聚物功能基MAL与PEG-SH交联剂功能基-SH的摩尔比例为1:1，POSS-SH的质量分数为0～4％，TEA缓冲液浓度为3～10mM，成胶时间为5～15min。

上述技术方案与细胞培养和细胞封装可以很好的匹配，可以实现制备POSS-PEG的同时进行细胞封装。

上述技术方案中：

4-arm-PEG-MAL为市售产品，优选的，选择平均分子量为5～20KDa的4-arm-PEG-MAL商品；

POSS-SH为市售产品，商品名为PSS-(3-巯基)丙基-七异丁基取代，CAS：480438-85-5；

PEG-SH可通过文献[Journal of Controlled Release,2007,122,287-296]所提供的制备方法制备得到。在本专利中，优选的，PEG-SH平均分子量为2～8KDa。

本发明还提供了上述技术方案制备得到的可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的制备方法制备得到的可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶。

本发明所提供的POSS-PEG杂化水凝胶通过将POSS纳米粒子(POSS-SH)接枝到四枝状长链亲水性PEG(4-arm-PEG-MAL)制备成两亲的POSS-PEG预聚物，以两端是巯基的可水解降解的PEG-SH为交联剂，通过Michael加成交联，只需在低浓度TEA缓冲液中就可快速制备可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶，避免了成胶过程中对细胞有害的自由基、紫外线和有机溶剂的使用，提高POSS-PEG杂化水凝胶3D封装细胞的生存能力。

本发明还提供了可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的作为组织工程支架材料的应用，用于再生医学。

优选的，用于在细胞培养液中封装细胞。具体为：在细胞培养液中进行POSS-PEG预聚物与交联剂PEG-SH的Michael加成交联聚合，在得到可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的同时进行细胞封装。

本发明所提供的可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的孔隙大小、机械强度、溶胀性、降解率可以通过改变杂化水凝胶中的POSS的质量分数进行精细调控，在3D细胞培养中快速成胶，使封装细胞的分布均匀，其生物相容性好、无毒且具有水解性。

附图说明

图1为POSS-PEG预聚物在水中的透射电镜图。

图2为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶形貌图。

图3为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶扫描电镜图。

图4为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶红外光谱图。

图5为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶储能模量的振荡应力扫描图及动态频率扫描图谱。

图6为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶溶胀曲线图。

图7为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶降解率图。

图8为可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶体外细胞培养活死细胞染色图及对应的CCK细胞活力测定图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下面的实施例1中提供可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶的制备方法，实施例2为力学性能检测实验，实施例3为溶胀率测试实验，实施例4为水解降解实验，实施例5为细胞生物相容性实验。通过以下实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1

POSS-PEG杂化水凝胶的制备

马来酰亚胺基交联的可水解的POSS-PEG杂化水凝胶通过以下方法来制备：将4-arm-PEG-MAL(Mn＝20KDa,北京健凯科技有限公司)和POSS-SH(Sigma-Adrich公司提供)溶解于3mL四氢呋喃中，室温搅拌3.5h后旋蒸掉溶剂得POSS-PEG预聚物，-20℃保存备用。然后POSS-PEG预聚物与PEG-SH(Mn＝4KDa)于不同浓度的三乙醇胺缓冲液(TEA，pH＝7.4)中混合均匀，得预成胶溶液。然后将上述预成胶溶液转移至5个600μl模具中，37℃生化培养箱中反应，制备得到水凝胶。制备过程中的4-arm-PEG-MAL、POSS-SH和可水解的交联剂的量、4-arm-PEG-MAL的分子量、三乙醇胺浓度以及成胶时间如表1所示。

表1各实施例中的参数设置：

上述实施例中，都能成胶，并且成胶时间都在20min以内。所得到POSS-PEG杂化水凝胶在扫描电镜下进行观察(图3)，结果显示，以上实施中，在3、4和10mM的三乙醇胺下，所实验的各POSS含量的预聚物都能与能水解的交联剂交联形成多孔状的交联结构。

图1为POSS-PEG预聚物在水中的透射电镜图；图2、3、4则分别为本发明所提供的可水解降解的POSS-PEG杂化水凝胶形貌图、扫描电镜图和红外光谱图。

如图1所示，所有的POSS-PEG预聚物均能制备成形态较好的水凝胶。POSS的加入可以影响POSS-PEG杂化水凝胶的的透明度。

如图2所示，POSS-PEG预聚物在水中具有一种非常特殊的核-壳结构。在这种核-壳结构中，核呈圆形，颜色较深；壳呈椭圆形，颜色明显较浅，并且从图中可以发现，POSS含量低的预聚物中壳内核的数量也较少、在水中的溶解性也更好。

如图3所示，所有的水凝胶都是多孔网络结构，平均孔径在20～50μm之间。

如图4所示，经过反应，4-arm-PEG-MAL的特征基团C＝C双键上C-H伸缩振动吸收峰消失，POSS-SH的特征基团S-H键的伸缩振动吸收峰消失，表明所述反应进行完全。

实施例2

力学性能检测实验

一组水凝胶由3个测试样组成，超纯水溶胀至平衡，用滤纸擦干表面水分，采用流变仪解析水凝胶力学性能，3个测试样取平均值。图5为水凝胶材料的储能模量(G’)的振荡应力扫描图谱及储能模量(G’)和损耗模量(G”)的动态频率扫描图谱。由图5可看出，采用本发明方法制备的水凝胶材料在所受应力从0.1Pa增加到10Pa时，储能模量(G’)随应力的变化没有明显变化，扫描频率范围为0Hz到10Hz时储能模量(G’)也无明显变化，表明水凝胶材料交联良好。相较于未加入POSS的纯PEG水凝胶，POSS-PEG杂化水凝胶机械强度更大，且机械强度随POSS含量增大而增大。

实施例3

溶胀率测试实验

一组水凝胶由3个测试样组成，冷冻干燥，准确称取其重量。将干水凝胶沉浸在0.9％氯化钠注射液(10mL)中，置于37℃恒温培养箱。在预定的时间，取出溶胀的水凝胶，用滤纸擦干表面水分后称重，直至水凝胶重量恒定不变。水凝胶的溶胀百分率(％)＝(溶胀后水凝胶质量-溶胀前水凝胶质量)/溶胀前水凝胶质量×100％，3个测试样取平均值。图6为溶胀曲线。由图6可看出本发明方法制备的水凝胶材料在前24h已经达到较高的溶胀比，并在100h后达到溶胀平衡。尽管POSS-PEG杂化水凝胶的平衡溶胀比随POSS含量增大而减小。但本发明方法制备的水凝胶材料平衡溶胀比在140至217之间，表明其仍具有良好的亲水性。

实施例4

水解降解实验

准确称取水凝胶，一组水凝胶由3个测试样组成。每组水凝胶加入0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4,9mL)，纯PEG水凝胶作为空白组，置于37℃恒温培养箱。不同时间间隔(3天)取出蒸馏水漂洗，冷冻干燥，称重。计算每组水凝胶在溶液中的累计降解百分率(％)＝(降解前水凝胶质量-剩余水凝胶质量)/降解前水凝胶质量×100％，3个测试样取平均值。图7为降解率图。由图可看出本发明方法制备的水凝胶材料12天以后的降解率在26％至65％之间，表明水凝胶材料具有水解性，并且随着POSS含量的增大，POSS-PEG杂化水凝胶降解率越低、降解速度越慢。

实施例5

细胞生物相容性实验

制得的不同POSS-SH质量分数预成胶液各3mL，与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)均匀混合，细胞密度为1×106/mL。取64μL置于96孔细胞培养板中，高度为2mm，5％CO2恒温培养箱37℃孵育30min，加入200uL含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，继续孵育，在第1天和第4天取出样本，进行活死细胞染色测试细胞活性，应用荧光显微镜分析图像，观察细胞活性及形态；并用CCK-8进行细胞活力测试，应用分光光度计检测吸光度推算活细胞数目。纯PEG水凝胶(0％POSS)为对照组。图8为体外细胞培养活死细胞染色图及对应的CCK细胞活力测定图。结果显示，细胞在水凝胶内部封装均匀，培养四天后均有较高的细胞活力，表明POSS-PEG水凝胶材料无毒且具有良好的生物相容性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。