一种逆转肝癌细胞sorafenib的耐药性的方法与流程

本发明涉及到细胞生物学技术，具体涉及一种采用aldh18a1-1shrna技术构建aldh18a1稳定低表达的smmc-7721细胞系的方法。

背景技术：

肝癌是肝脏系统的恶性肿瘤，发病率占全球肝癌发生率的55％，死亡率居世界首位。索拉菲尼(sorafenib)是唯一被fda批准的临床用于治疗肝癌的靶向药物。sorafenib是一种多激酶靶点的抑制剂，不仅可以抑制raf激酶，也可以抑制血管内皮生长因子受体(vegfr)和血小板衍生生长因子受体(pdgfr)受体。研究显示尽管sorafenib一定程度的提高了三期临床上肝癌患者的生存期，但事实上患者中的药物响应程度普遍较低，效果远不尽如人意。近年来对sorafenib耐药的机制得到了越来越多的关注，导致sorafenib耐药的机制是非常复杂的。

肿瘤的缺氧微环境(hypoxia)导致sorafenib耐药性，肿瘤缺氧与传统的放化疗耐药性，肿瘤转移和复发高度相关。有文献报道在sorafenib耐药的肝癌组织中缺氧诱导因子(hif1α)的表达显著高于非耐药组，抑制hif2α的表达和活性可以逆转该癌细胞对sorafenib的耐药性。更重要的是，长期使用sorafenib可以抑制了肿瘤组织的血管生成，增加了肿瘤缺氧，从而导致细胞对sorafenib的耐药性，这样极大的限制了sorafenib的临床药效，也使得靶向肝癌组织缺氧成为更吸引人的研究领域。

最新的研究表明在肾癌中，缺乏门冬氨酸或谷氨酰胺匮乏的肿瘤细胞生长和存活高度依赖脯氨酸的生物合成。在人黑色素瘤中，抑制脯氨酸合成通路显著抑制了癌细胞的增殖。另外，最新的研究显示羟基脯氨酸可能作为代谢的枢纽，参与了低氧条件下癌细胞的存活。

技术实现要素：

本发明涉及辅助治疗肝癌的新方法，目的之一是阐明肝癌中脯氨酸生物合成与临床上由缺氧引起的sorafenib的耐药相关性；目的之二是明确通过抑制脯氨酸的生物合成来逆转肝癌对sorafenib的耐药性。shaldh18a1质粒从origene公司购买，货号是tl314847。

实验结果表明，在低氧条件下，脯氨酸生物合成促进了肝癌细胞的生存，增加了sorafenib的耐药性。

本发明公开一种新发现的可以对sorafenib耐药性产生影响的通路-脯氨酸合成通路。具体采用shrna干扰技术在smmc-7721细胞中干涉掉aldh18a1，以达到抑制脯氨酸合成的目的，经过细胞活力检测和蛋白免疫印迹实验检测证实，脯氨酸合成的抑制能够逆转肝癌细胞对sorafenib的耐药性，从而达到有效治疗肝癌的目的。

附图说明

图1.smmc-7721-scramble和smmc-7721-shaldh18a1细胞分别加或不加10μmsorafenib在通入体积浓度20％o2或1％o2气体条件下处理48小时后，进行细胞活力检测。

图2.smmc-7721-scramble和smmc-7721-shaldh18a1细胞分别在20％o2或1％o2条件下加或不加10μmsorafenib处理24小时后，收取细胞裂解液，通过westernblot实验，用细胞凋亡相关蛋白进行检测。

图3.为实施例4通过westernblot实验的结果示意图。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实例1raf-1、b-raf和vegfr-2多激酶抑制剂sorafenib的溶液制备。

sorafenib用dmso溶解制备成储存液浓度为100mm。sorafenib加含10％胎牛血清的dmem培养液稀释至10μm作为工作浓度。

实例2smmc-7721-scramble和smmc-7721-shaldh18a1稳转细胞系的构建

shaldh18a1质粒从origene(tl314847)购买，将shscramble和shaldh18a1质粒分别和病毒包装载体pspax2，pvsv.g包装成病毒(质量比4:3:1)，而后于4ml含10％胎牛血清的dmem培养液中三种质粒的加入量依次为12μg、9μ、3μg，病毒侵染smmc-7721细胞，将细胞传代到10cm皿中，传代第二天开始嘌呤霉素的筛选，开始浓度为1ug/ml，直到不再出现大量死亡浓度增加到2ug/ml.一直持续筛选，出现克隆后，挑取单克隆进行培养。细胞扩大培养后增加药物浓度3ug/ul继续筛选，直到无大量死亡再增加药物浓度4ug/ml，筛选后扩大培养并进行沉默效果检测，得到理想效果后冻存。其结果如图1所示，在smmc-7721细胞中敲低了aldh18a1的表达。

实例3脯氨酸合成抑制和sorafenib的联合作用对肝癌细胞的抑制作用。

将smmc-7721-scramble和smmc-7721-shaldh18a1细胞消化成单个细胞，而后进行细胞计数，将每种3x10³个细胞铺到96孔板中，分成8各组，分别为20％o2smmc-7721-scramble，20％o2smmc-7721-scramble加sorafenib处理，20％o2smmc-7721-shaldh18a1，20％o2smmc-7721-shaldh18a1加sorafenib处理，1％o2smmc-7721-scramble，1％o2smmc-7721-scramble加sorafenib处理，1％o2smmc-7721-shaldh18a1，1％o2smmc-7721-shaldh18a1加sorafenib处理，sorafenib处理24小时后，利用celltiterglo方法进行细胞活力检测，其结果如图2所示，在smmc-7721敲低aldh18a1(抑制脯氨酸合成)后加sorafenib处理在常氧和低氧条件下抑制了肝癌细胞的增殖。

实例4脯氨酸合成抑制促进肝癌细胞的凋亡。

将smmc-7721-scramble和smmc-7721-shaldh18a1细胞铺到6cm皿中，分成8各组，分别为20％o2smmc-7721-scramble，20％o2smmc-7721-scramble加sorafenib处理，20％o2smmc-7721-shaldh18a1，20％o2smmc-7721-shaldh18a1加sorafenib处理，1％o2smmc-7721-scramble，1％o2smmc-7721-scramble加sorafenib处理，1％o2smmc-7721-shaldh18a1，1％o2smmc-7721-shaldh18a1加sorafenib处理，sorafenib处理24小时后，收取细胞蛋白，利用westernblot实验进行检测。其结果如图3所示，在常氧条件下，aldh18a1的敲除(脯氨酸合成抑制)和sorafenib协同作用，促进肝癌细胞的凋亡；在低氧条件下，单独敲除aldh18a1就能促进肝癌细胞的凋亡。

通过上述实验表明，脯氨酸代谢通路涉及到肝癌的发展，脯氨酸合成可以使sorafenib产生耐药性，因此，抑制脯氨酸的合成能够抑制肿瘤细胞的生长，使肝癌细胞对sorafenib敏感，从而达到治疗肝癌的目的。