一种肿瘤个体化基因检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及医用设备技术领域，具体为一种肿瘤个体化基因检测试剂盒。

背景技术：

恶性肿瘤又称为癌症，是严重危害生命健康的常见的多发的疾病。据世界卫生组织WHO统计，在2008年全球有一千二百多万新增恶性肿瘤患者，其中七百六十万人死恶性肿瘤。而这一数字在近几年来将持续增长，据推测，全球癌症发病率到2020年前将增加50%，即每年将新增一千五百万癌症患者。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升，2030年这个数字可能会达到一千三百多万。

在目前对恶性肿瘤的治疗中，临床上最常釆用的是手术治疗、放射治疗和化学治疗。而且随着科学技术的进步，越来越多的临床医生也把目光投向了生物免疫治疗，包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体治疗等。

药物基因组学是分子药理学、基因功能学和遗传学的有机结合，是研究个体间不同的遗传因素影响机体对药物反应的关系的交叉学科。疾病发生的内在分子机理并不是药物基因组学的研究重点，药物基因组学主要研究个体差异即基因结构多态性与不同药物反应之间关系，解释了不同个体之间产生不同的药物治疗效果的原因。肿瘤个体化治疗包括分子祀向治疗与个体化化疗两个部分：（1）分子勒向治疗：这种治疗主要就是利用分子勒向药物在人体内与範位点特异性的结合，“杀死”肿瘤细胞，例如，美国ASCO消化肿瘤会议认为结直肠癌患者必须在使用西妥昔单抗进行革巴向治疗前对K-ras基因进行检测，携带K-ras野生基因型患者服用此药的疗效比较好，而携带突变基因的患者不能从治疗中获益；（2）个体化化疗：检测患者对特定化疗药物的敏感性及药物对个体的毒性反应的相关基因，以配合临床使用合适的化疗药物及化疗剂量。有助于对不同的患者制定相应的个体化化疗方案，减少化疗药物使用的盲目性。

现有技术中，用于肿瘤个体化用药相关基因位点的突变检测及基因多态性检测，主要应用测序法，试剂盒一般结构包括盒体、盒体上部设有盒盖，盒体的腔体内设有固定座和试剂瓶槽，在固定座上设有1.5ml EP 管容器孔和0.5ml EP 管容器孔，所述的1.5ml EP 管容器孔内设有 1.5ml EP 管，所述 0.5ml EP 管容器孔内设有 0.5ml EP 管，所述试剂瓶槽内设有装 PCR 酶液等试剂的试剂瓶，这种试剂盒体积一般较大，不便于携带，使用时需要对试剂反复冻融，操作步骤复杂，影响试剂的有效性，为此我们提出一种肿瘤个体化基因检测试剂盒用于解决上述问题。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种肿瘤个体化基因检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：一种肿瘤个体化基因检测试剂盒，包括试剂盒外壳，所述试剂盒外壳内设有两个大小一致的磁珠区固定软垫、一个Barcode固定软垫、一个末端修复固定软垫、一个接头反应固定软垫、一个扩增子反应固定软垫和一个扩增子反应MIX固定软垫。

优选的，两个所述磁珠区固定软垫分别设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅰ，其上分别插入磁珠、WP溶液Ⅰ、WP溶液Ⅱ和TE Buffer。

优选的，所述Barcode固定软垫上设置有十二个0.2ml的PCR反应管插孔Ⅰ，所述PCR反应管插孔Ⅰ内均插有PCR反应管，每个PCR反应管中装有一种含有特性标签序列的Barcode溶液。

优选的，所述末端修复固定软垫上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅱ，分别插入两管末端修复溶液和两管无核酸水。

优选的，所述接头反应固定软垫上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅲ，分别插入两管接头反应溶液和两管接头溶液。

优选的，所述扩增子反应固定软垫上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅳ，分别插入两管扩增酶溶液和两管无核酸水。

优选的，所述扩增子反应MIX固定软垫上设置有十二个0.2ml的PCR反应管插孔Ⅱ，所述PCR反应管插孔Ⅱ插有PCR反应管，每个PCR反应管中装有相同的扩增子反应MIX溶液10μl，主要包括：扩增子捕获引物、dNTP、PCR反应Buffer和无核酸水。

优选的，所述试剂盒外壳的底部设有隔热垫，该隔热垫的底部设有防滑纹，可用于为试剂盒外壳隔绝底部的热量，防止外界温度对内部试剂的影响，所述试剂盒外壳的外侧壁上设有防滑贴层，该防滑贴层与试剂盒外壳活动连接，可用于防止取用时打滑。

优选的，所述试剂盒外壳上设有多个缓冲胶条，该缓冲胶条设置在所述试剂盒外壳的外侧壁的棱上，可在试剂盒外壳受到撞击、摔落等震荡的时候起到缓冲作用，保护检测试剂管和检测试剂瓶。

优选的，所述Barcode固定软垫上设有十二个Barcode溶液管插孔，所述arcode溶液管插孔内均设有Barcode溶液管，所述Barcode溶液管的管盖上设有特定的标号，所述标号通常用序号或英文字母标识，可对应试剂盒说明书找到该Barcode溶液的标识序列。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：本实用新型能较好的应用于肿瘤个体化用药相关基因位点的突变检测及基因多态性检测，且体积小、独立设置，便于携带和使用，可有效避免因试剂反复冻融造成的试剂失效及试剂交叉污染、气溶胶污染。

附图说明

图1为本实用新型结构示意图；

图2为本实用新型中Barcode固定软垫结构示意图。

图中：1试剂盒外壳、2磁珠区固定软垫、3 Barcode固定软垫、301 Barcode溶液管插孔、302 Barcode溶液管、303标号、4末端修复固定软垫、5接头反应固定软垫、6扩增子反应固定软垫、7扩增子反应MIX固定软垫、8 1.5ml离心管插孔Ⅰ、9 PCR反应管插孔Ⅰ、10 1.5ml离心管插孔Ⅱ、11 1.5ml离心管插孔Ⅲ、12 1.5ml离心管插孔Ⅳ、13 PCR反应管插孔Ⅱ。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

请参阅图1-2，本实用新型提供一种技术方案：一种肿瘤个体化基因检测试剂盒，包括试剂盒外壳1，试剂盒外壳1内设有两个大小一致的磁珠区固定软垫2、一个Barcode固定软垫3、一个末端修复固定软垫4、一个接头反应固定软垫5、一个扩增子反应固定软垫6和一个扩增子反应MIX固定软垫7。

进一步的，两个磁珠区固定软垫2分别设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅰ8，其上分别插入磁珠、WP溶液Ⅰ、WP溶液Ⅱ和TE Buffer。

进一步的，Barcode固定软垫3上设置有十二个0.2ml的PCR反应管插孔Ⅰ9，PCR反应管插孔Ⅰ9内均插有PCR反应管，每个PCR反应管中装有一种含有特性标签序列的Barcode溶液。

进一步的，末端修复固定软垫4上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅱ10，分别插入两管末端修复溶液和两管无核酸水。

进一步的，接头反应固定软垫5上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅲ11，分别插入两管接头反应溶液和两管接头溶液。

进一步的，扩增子反应固定软垫6上设置有四个1.5ml离心管插孔Ⅳ12，分别插入两管扩增酶溶液和两管无核酸水。

进一步的，扩增子反应MIX固定软垫7上设置有十二个0.2ml的PCR反应管插孔Ⅱ13，PCR反应管插孔Ⅱ13插有PCR反应管，每个PCR反应管中装有相同的扩增子反应MIX溶液10μl。

上述的试剂盒外壳1的底部设有隔热垫，该隔热垫的底部设有防滑纹，可用于为试剂盒外壳1隔绝底部的热量，防止外界温度对内部试剂的影响，试剂盒外壳1的外侧壁上设有防滑贴层，该防滑贴层与试剂盒外壳1活动连接，可用于防止取用时打滑。

上述的试剂盒外壳1上设有多个缓冲胶条，该缓冲胶条设置在试剂盒外壳1的外侧壁的棱上，可在试剂盒外壳1受到撞击、摔落等震荡的时候起到缓冲作用，保护检测试剂管和检测试剂瓶。

Barcode固定软垫3上设有十二个Barcode溶液管插孔301，arcode溶液管插孔301内均设有Barcode溶液管302，Barcode溶液管302的管盖上设有特定的标号303，标号303通常用序号或英文字母标识，可对应试剂盒说明书找到该Barcode溶液的标识序列。

上述的试剂盒主要用于检测肿瘤个体化用药相关基因的突变及多态性检测，针对癌症的分子分型、靶向治疗和病程监控等目的设计，精选了50个与癌症发生发展密切相关的基因，利用扩增子富集方法对这些基因的热点突变区域进行文库构建和目标高通量测序。本项目扩增子引物覆盖2800多个COSMIC数据库收录的基因突变，其中包含目前最常用的靶向药物靶点，如如肺癌EGFR的p.T790M、p.L858R，KRAS的p.G12D、p.Q61H，黑色素瘤和结直肠癌BRAFp.V600E等。

本试剂盒保存于4℃，尽量减少反复冻融。

本实用新型中试剂盒的具体使用方法：

1、提取组织基因组DNA：

利用商品化试剂盒提取肿瘤石蜡切片组织或新鲜组织基因组DNA，利用Qubit检测基因组DNA的浓度，并稀释到10ng/μl。

2、目的片段扩增

打开肿瘤个体化用药相关基因检测试剂盒，从盒内扩增子捕获试剂区，取出一管扩增子捕获引物MIX，及扩增酶，离心后出置于冰盒上；

配置扩增子反应体系：向扩增子MIX管中加入酶0.5μl，基因组2μl和无核酸水7.8μl，充分混匀后，离心，置于冰上；

将八连管放置与PCR仪器中，进行 PCR 程序： 95 ℃预变性 5 分钟；然后进行30个循环：94 ℃变性 30 秒， 60 ℃反应40秒；4℃，holding。

3、扩增子筛选及纯化

打开肿瘤个体化用药相关基因检测试剂盒，从盒内磁珠纯化区内取出磁珠纯化试剂，对扩增子反应产物进行片段筛选和纯化，最终用25μl的TE buffer 溶液溶解洗脱。

4、末端修复及纯化

将上一步纯化获得的扩增子产物中取出30μl，加入末端修复试剂80μl，在室温下反应20min。利用磁珠纯化试剂，对末端修复产物进行纯化，最终用30μl的TE buffer 溶液溶解洗脱。

5、接头连接及纯化

自肿瘤个体化用药相关基因检测试剂盒内取出特定Barcode一管和接头管、接头反应试剂管，融化后离心，置于冰上；

向接头管中加入末端修复产物25μl，接头1μl、反应液70μl，混匀后离心，置于PCR仪中，反应条件为：25℃，15min ；72℃，5min ；4℃，holding。

连接完接头之后，利用磁珠纯化试剂，对接头连接产物进行纯化，最终用20μl的TE buffer 溶液溶解洗脱。

不同的组织、样本可利用不同的Barcode管，使其连接不同的Barcode序列，便于文库混合测序后的样本区分。

尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。